秀丽线虫基因敲除突变库中sec-10突变种系的筛选.pdfVIP

第 32卷第 3期 湖北大学学报(自然科学版) Vo1．32 No．3 2010年 9月 JournalofHubeiUniversity(NaturalScience) Sep．，2010 文章编号：1000—2375(2010)03—0318—05 秀丽线虫基因敲除突变库中see-lO突变种系的筛选 李江丽，张蓉颖 (华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430074) 摘要：从秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans)的基因突变库中筛选出目的基因的突变种系，并对其进 行分子机制的研究，是研究不同基因及其蛋白产物作用机制的一项基本技术．以se~lO突变种系的成功筛选 为例，详细描述如何通过 PCR检测方法从笔者实验室所构建的国内第一个秀丽线虫基因敲除突变库 (可进行 多达几百次的筛选量)中筛选出目的基因的突变种系，同时证明突变库的可用性．根据 seelO基因序列设计多 套针对不同靶点的含干扰引物的巢式引物，通过凝胶电泳正确判断扩增产物的特异性和干扰引物对长片段产 物的抑制特性 ，以选择有效的检测引物．简化了线虫复苏后的饲养方法，以取代恒温恒湿培养箱的使用．通过 纯和致死平衡子的引入，克服了seelO基因突变致死所导致的无法稳定传代的问题．总结了从秀丽线虫基因 突变库中筛选突变种系的注意要点，为国内其它线虫基因突变库的筛选提供重要的参考意见． 关键词：秀丽隐杆线虫；基因敲除；筛选；PCR检测；se~lO 中图分类号：Q31；Q291 文献标志码：A 模式生物秀丽隐杆线虫在生命科学研究中发挥着举足轻重的作用．这不仅 由于其已经被解析的全 基因组序列及其具有约40 与人类基因组同源 的基因，还因为它具备作为模式动物所必需的多个特 征：饲养方便廉价；可像其他动物细胞一样在--80℃保存 ；生长周期短，传代快；体小，通体透 明，易于在 显微镜下对活体组织和细胞进行跟踪观察．此外，由于具有雄性和雌雄同体两种性别特征，不仅可以允 许不同遗传背景的线虫进行遗传交配，而且也可以仅 以雌雄同体的形式传代从而保持其单纯的遗传背 景，这一点使其在遗传研究上具有其他模式动物无可比拟的优势． 基因敲除是线虫研究过程中的重要技术之一，即通过分子操作改变生物体 内某已知基因的DNA 序列，对基因进行完全或不完全的去除致使其功能丧失，以便对 目的基因在生物体 内的功能开展进一步 研究_1j．通过基因敲除可以得到遗传背景中完全没有 目的基因表达产物的突变种系，克服了RNAi过 程中有残余蛋 白质作用的缺陷；由于改变了基因组序列，敲除所得的突变可以无限遗传，而不同于 RNAi技术的瞬时干扰；通过基因敲除得到的特定基因的突变体线虫可以和其他基因的突变体线虫进 行杂交获得双突变甚至多突变的种系 ，以便进行多个蛋 白质相互作用 的研究．因此，作为一个经典的反 向遗传方法，基因敲除技术依然保持着其无可取代的地位． 本文中以我们实验室构建的线虫基因突变库为对象，在简单描述基本原理的基础上，将前人的研究方 法[3]和我们自己的实验经验相结合，介绍从线虫库中筛选 目的基因的方法，以sec-lO为例，总结了该过程的实 验技巧和可能出现的问题以及相应的解决策略．线虫中的sec-lO与人的sec~lO蛋白有着高达 37 的序列相似 性[4]，是高度保守的蛋白质复合体 exocyst的八组分之一，在分泌途径中起着囊泡栓系的作用 ]． 1 材料与方法 1．1 酶和试剂 Taq酶(TaqPCRMasterMix，TIANGENKT201)．单虫裂解液：商spH8．0，3Ommol／L； EDTA8mmol／I；Naai00mn~l／L；NP400．796／；Tween200．7 ．蛋白酶K，10rag／mE，--e0~C~g． 收稿 日期 ：2009—11—07 基金项 目：国家 自然科学基金 资助 作者简介：李江丽 (1981一)，女，博士生；张蓉颖，通信作者，Email：ryzhang@mail．hust．edu．cn 第 3期 李江丽等：秀丽线虫基因敲除突变库中se~lO突变种系的筛选 31