Ezrin基因shRNA表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

一 1524一 重庆医科大学学报2010年第35卷第 lO期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2010．VOI．35NO．10) 基础研究 文章编号：0253—3626(2010)10—1524—04 Ezrin基因shRNA表达载体的构建及鉴定 王忠 良 ，李旭 良 ，李 明 ，张德文 ，，刘传康 ·，覃佳强 ，刘官倍 ， (1．重庆医科大学附属儿童医院骨科，重庆 400014；2．重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科，重庆 400014；3．儿童发育疾病 研究省部共建教育部重点实验室，重庆 400014) 【摘 要】目的：设计并构建能有效下调Ezrin蛋白表达的短发夹状RNA(SmallhairpinRNA，shRNA)表达载体 ，探讨载体介导的 RNA干扰技术用于预防性治疗骨肉瘤肺转移的可行性。方法：依据小干扰RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)靶序列的设计原 则 ，以Ezrin蛋白编码基因Villin2为靶基因，合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列，经退火合成 DNA双链，再克隆至 shRNA表达载体pGenesil一1质粒中，转化后进行酶切鉴定和DNA序列测定 。将构建的载体用脂质体介导转染大鼠骨肉瘤 UMR106细胞株，采用 RT—PCR和Westernblot法检测细胞Ezfin蛋 白在mRNA和蛋 白水平的表达。结果：成功构建 2个针对 Ezrin蛋白的shRNA表达载体；其转染大鼠骨肉瘤 UMR106细胞后，细胞Ezrin蛋白表达在mRNA及蛋白水平上的表达均显著 下降。结论：Ezrin蛋白的shRNA表达载体能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR106细胞Ezfin蛋白的表达，本研究为预防性治疗骨肉瘤 肺转移的实验奠定基础。 【关键词】Ezrin蛋白；RNA干扰；骨肉瘤；肺转移；表达载体 【中国图书分类法分类号】Q782 【文献标识码】A 【收稿 日期】2009—11-19 CloningandidentificationtheshRNAexpressionplasmidforEzringene WANGZhong-liang，etal (DepartmentofOrthopaedics，theChildren’SHospital，ChongqingMedicalUniversity) A【bstract]Objective：ToconstructsmallhairpinRNA (shRNA)expressionplasmidswhichcaneffectivelyknockdownEzrinprotein expression，andtoexplorecarrier—mediatedRNA interferencetechnologyforthepreventivetreatmentofosteosareomalungmetastases． Methods：AccordingtothecriteriaofdesigningsmallhaiprinRNA (siRNA)，twovillin2(codinggeneofEzrinprotein)shRNAtemplate DNA sequencesweredesignedandsynthesized．TheannealedshRNA templatewasinsertedintoexpressionvectorpGenesil-1．The positiveplasmidswereidentifiedbyenzymedigestionandDNA sequencing．Thentheplasmidsweretransfeetedintoratosteosareoma UMR106cellswithliposomemediation，andtheexpressionsofEzfinmRNA anditsproteinweredetectedbyRT-PCR andW esternblot． Results：TwoshRNA expressionplasmidsofrEzrinwereconstructedsuccessfully．Afterthetransfection．th