短发卡RNA抑制人端粒酶逆转录酶表达对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响.pdfVIP

山东医药2012年第 52卷第 17期 短发卡 RNA抑制人端粒酶逆转录酶表达 对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响 张宏顺 ，马衍刚 (1开滦医疗集 团钱家营医院，河北唐 山063301；2聊城市人 民医院) 摘要 ：目的 探讨短发卡RNA(shRNA)对人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的抑制作用，以及其对人胶质瘤细 胞U251增殖、凋亡的影响。方法 构建针对hTERT的shRNA表达质粒，脂质体介导转染人胶质瘤细胞U251，采 用RT．PCR、Westernblotting技术检测 目的基因的表达 ，PI．DNA染色、流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡。结果 成功构建了hTERT的shRNA表达质粒，其转染 U251胶质瘤细胞后，hTERT基因表达明显降低 (P0．05)，细胞进 入 s期出现障碍 ，停滞在Go／G．期的细胞增多，凋亡细胞增加。结论 针对hTERT的shRNA干扰效果明确，其可 抑制胶质瘤细胞增殖，促进其凋亡。 关键词：脑胶质瘤；载体 ，蛋白质类；人端粒酶逆转录酶；转染 中图分类号：R739．41 文献标志码 ：A 文章编号：1002-266X(2012)13-0044-02 胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，胶质 序鉴定，扩增，一20℃备用。 瘤内端粒酶的上调或重新激活是其无限增殖、生长、 1．2．2 质粒DNA／Siportxp-1转染 U251胶质瘤细 侵袭转移所必需的，人端粒酶逆转录酶 (hTERT)是 胞 脂质体与DNA比例为3txL：1txg，分为空白对 端粒酶的限速酶 J。RNA干扰 (RNAi)是生物体 内 照组、hTERT于扰组、阴性质粒组，每孔细胞 5× 抑制特定基 因表达的一种现象，而短发卡 RNA 1O／L，分别于转染后 1、3、5、7d收集细胞，检验 目 (shRNA)可更明确、高效、稳定地干扰 目的基因的表 的基因的活性。 达 J。2010年6月 一2011年 7月，我们设计针对 1．2．3 hTERT基因表达检测 采用 RT—PCR技术 hTERT的 shRNA表达质粒，转染人胶质瘤细胞 提取总RNA，使用两步法、RT．PCR试剂盒操作，引 U251，旨在探讨RNAi治疗胶质瘤的可行性。 物由Invitrogen公司合成。hTERT上游引物 5一TC— 1 材料与方法 TAcCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA一3，下游 弓f物 5一 1．1 材料 pSilencer1．0一U6载体 (Line)，pSilencer GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA一3 ：GAPDH 上 1．0一U6GAPDHControl(Circular)，转染试剂 Siport 游弓I物 5一ACCACAGTCCATGCCATcAC一3，下游 弓I xp一1购 自美 国Ambion公司，T4DNA连接酶限制性 物 5，_TCCACCACCCTGTTGCTGTA一3。PCR产物用 内切酶(Promega公司)，胶质瘤细胞株U251。 1％琼脂糖电泳分离鉴定，凝胶成像仪显像。 1．2 方法 1．2．4 hTERT蛋 白表达检测 采用 Westernblot— 1．2．1 寻找针对 hTERT合适 的靶序列 采用 ting技术收集细胞 3×10／L，用磷酸盐缓冲液、PBS BLAST软件对选择的靶序列进行同源分析，排除抑 洗涤3次后，提取蛋 白，测 OD值。配制标准蛋 白浓 制其他基 因片段 的可能。3端加入终止信 号 度(50 )加上样缓冲液，100oC5min变性；取 n’r1w ，两端分别加入 ApaI和 IcorRI的酶切位 样品45 L上样于 10％SDS．聚丙烯酰氨凝胶进行 点，并加入 LOOP环，克隆入 pSilencer1．0一U6质粒 垂直电泳，湿转63min。NC膜依次放人封闭液、一 u6启动子的下游。hTERT靶基因(NM003219，