PCR技术在畜禽传染病诊断中的应用.pdfVIP

论坛I ： PCR技术在畜禽传染病诊断巾的应用 文 ／冷毕丹 PCR，即聚合酶链 式反应 ，英 文pOlymerase chain (g：10 )水平 ，能从 100万个细 胞中检 出一个靶细 胞 。 reaction的缩写 ，又称基 因体外扩增技术 ，是在一对 引 在病毒 的检测 中，PCR的灵敏度 可达 3个RFU (空斑形 成单 物定 向引导下 ，用DNA聚合酶对DNA中作为模板 的特 异 位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌 。 性靶 序 列进 行体 外扩 增 的技 术 。PCR技 术 是美 国马利斯 (2)简便 快速 。PCR反应用耐 高温 的TaqDNA聚合酶 ， (K．B．Mulli))等在 1985~提 出的。它可 以从极微量 的生 一 次性地将 反应液 加好 后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行 物材料 中简便、快速 地得到大量特 定基 因，或在众 多复杂 “变性一退火一延伸 ”反应 ，一般在2～4 小时完成扩增反 的生物基 因中检测 出单拷 贝基因。 应 。扩增 产物一般用 电泳分析 ，不 一定要用 同位 素， 电泳 与传统 的畜禽传染病诊 断方法 ，如细菌学 、病毒学、 分析无放射性污染 ，易推广。 免疫学等方法相 比，PCR技术快速方便 、敏感性高、特异性 (3)对标本的纯度要求低 。不 需要分离病毒或细菌及 强 、操作简便 。 目前 ，PCR技术 已在 畜禽传染病诊 断 中发 培养细胞 。DNA粗制品及RNA均可作 为扩增模板 ，直接用I临 展得 比较 成熟 ，特别 是在多种病 毒性疾病 的诊 断 中已相 继 床标本如 血液 、体腔液 、洗嗽液 、毛发、细胞 、活组织等 得到应用 ，如猪蓝耳病、猪细 小病毒病 、伪狂 犬病 、猪 圆 DNA扩增检测 。 环病毒病、 口蹄疫 、猪瘟 、猪 乙型脑炎 、禽流感 、鸡 白血 2。PCR技术的缺点 病、鸡新城疫等。 由于过 高敏 感性 容 易导致 交叉扩 增 ，当实验 室 污染 后 ，可 能出现假 阳性 结果 ，而在 引物针 对范 围过 窄或存在 一 、 PCR技术基本原理 抑制剂情 况下还会 出现假阴性结果 类 似于DNA的天然复制过程 ，其特异性依赖于与靶序列 三、PC刚支术在膏禽传染瘸诊断中的应用 两端互补的寡核苷酸 引物 。PCR由 “变性一退火一延伸 ”三 个基本反应步骤构成 ： 1．诊听细蕾性痰■ 1．横板DNA的变性 (1)猪 呼吸道 致 病 菌混 合 感 染 。胸膜 肺 炎放 线杆 加热模板DNA至93℃左 右一 定时 间后 ，其DNA~(链 或 菌 、多杀性 巴氏杆 菌和 副猪 嗜血 杆 菌都 是猪 呼吸道 常见 经PCR扩 增形成 的双链DNA解离 ，成 为单链 ，以便与 引物结 的重要 致病 菌 ，都 可 能导致 或 者继 发于其他 病 原感 染 。 合 ，为下轮反应做准备 。 这三 种 细菌 引起 的临床 症状 很难 区分 ，多重 感 染也给传 2．撰扳DNA与引■的退火 (量性 ) 统 的细菌学诊断方法带来 困难 。PCR检测方法在检测临床 模板DNA经加热变性成单链后 ，温度降至55C左右 ，引 样 本 时 ，尤 其 是 当多种 其他 物 种 的DNA存在 时 ，可 能会 物与模板DNA单链 的互补序列配对 结合 。 出现 非特异 性 扩增 。当非特 异 性扩 增产 物 的大 小和 预计 3．引■的蠢伸 ：ONA横板 阳性产物 大小相似 时 ，就 可