病理性瘢痕成纤维细胞模型的建立.pdfVIP

维普资讯 州医学b2008年第 31卷第 1j}l 病理性瘢痕成纤维细胞模型的建立 苏卫国 李永林 祁强 林伟 赵小瑜 摘【 要】目的 建立病理性瘢痕成纤维细胞体外模型，为观察其生物学行为、研究病理性瘢 痕发生机理奠定基础。方法 以病理性瘢痕和正常皮肤为标本，组织块培养法原代培养成纤维 细胞 ．经传2-3代后冻存、复苏细胞，观察细胞游 出、增殖、复苏后活力情况等。结果 7~12天左 右 ，病理性瘢痕成纤维细胞游出，3周左右可以首次传代 ，收集 2~3代细胞经冷冻、复苏后细胞 活力佳，性状稳定，为合适的病理性瘢痕成纤维细胞模型。结论 组织块培养法结合细胞冻存 ， 可以成功建立病理性瘢痕成纤维细胞模型。 关【键词】病理性瘢痕 成纤维细胞 模型 皮肤受损后组织的异常修复 ，常导致病理性 5日后首次换液，以后每 3日左右换液一次，方法 愈合 即瘢痕疙瘩和增生性瘢痕 的发生。成纤维细 同上，细胞游出后每次换液加入 3ml的DMEM培 胞是病理性瘢痕发生的生物学基础 ，体外培养并 养基 (含 1O％胎牛血清和双抗溶液)。 观察瘢痕成纤维细胞 的生物学行为是重要 的瘢痕 1．2．2 传代培养成纤维细胞 弃去培养瓶 中的 研究方法。本实验取病理性瘢痕患者瘢痕组织标 培养基 ，PBS液将培养瓶内细胞冲洗两遍 ，加入适 本 ，体外分离 、培养瘢痕组织成纤维细胞 ，为研究 量的0．25％胰蛋 白酶溶液 ，细胞脱落后加少量含血 病理性瘢痕形成机制提供成纤维细胞模型。 清培养基终止消化，吹打瓶壁细胞形成细胞悬液， 1 材料与方法 1000rpm离心细胞悬液 5min，弃上清液 ，加入 1．1 材料 DMEM培养基 (含 10％NBS和双抗溶液)，调整细 1．1．1主要试剂及仪器 DMEM细胞培养基 、胰蛋 胞数量接种于培养皿或培养瓶 中。2日后首次换 白酶 (美 国Gibco公司)；胎牛血清和新生牛血清 液 ，以后每 3日换液 ，细胞在瓶底融合生长达到 (杭州四季青生物公司)；PBS液 (成品粉剂 ，武汉博 80％以上时，再次进行传代培养 。 士德公司)；亚 甲基二砜 (美 国Sigma公司)；双抗液 1．2_3 细胞冻存[3】选第 2-3代培养细胞 ，制备单 (链霉素、青霉素，华北制药厂)；超净工作台(苏州 细胞悬液 (方法 同细胞传代 )，1000rpm离心 空气净化设 备厂 )；CO：培养箱 (95％空气 、5％ 5min，去除上清液 ，将配制好 的冻存液 (60％ CO：，37oC)；倒置显微镜 (重庆光学仪器厂)；离心机 DMEM+3O％ 胎牛血清+1O％亚甲基二砜)加入离 (北京医用离心机厂)；25ml细胞培养瓶 ；75ml细 心管中，并调整冻存液 中细胞的最终浓度 1×1o6～ 胞培养皿 ，细胞冻存管(美国Gibco公司)。 2~10个／ml，分装于 2ml冻存管 中，封 口，梯度降 1．1．2标本 瘢痕整复手术过程 中切取病理性瘢痕 温 。 患者瘢痕及瘢痕周围少量正常皮肤 ；皮片移植手 1．2．4 细胞复苏3[ 从液氮罐或超低温冰箱中取 术多余的断层皮片或包皮环切术去除的包皮组织 出冻存管 ，置人 37℃水浴 ，快速融化 ，吸出冻存管 (瘢痕疙瘩 、增生性瘢痕 ，正常皮肤各 3例)。 内的细胞悬液 ，接种细胞于预先已加培养基 的培 1．2 方法 养皿中，置人 COz培养箱静置培养 ，12小时后弃去 1．2．1 组织块培养法原代培养成纤维细胞[1】在 上清液 ，加入适量 DMEM培养基 (含 10％胎牛血清 含适量 DMEM培养基 (含 2