敬钊毒素-V突变体K12A—JZTX—V的化学合成与氧化还原复性.pdfVIP

维普资讯 第27卷第 5期 怀化学院学报 V01．27．No．5 2008年 5月 JOURNALOFHUAlHUA UNlVERSlTY May．，2008 敬钊毒素一V突变体 K12A—JZTX—V的化学合成 与氧化还原复性 曾雄智 ， 全妙华 ， 皮建辉 ， 梁宋平 (1．湖南师范大学 蛋 白质化学与发育生物学教育部重点实验室， 湖南 长沙 410081； 2．怀化学院 生物工程系， 湖南 怀化 418008) 摘 要：敬钊毒素一V (Jingzhaotoxin—V，JZTX—V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感 型钠通道抑制剂 ，由29个氨基酸残基组成 ，含有三对二硫键 ．为 了深入研究该毒素的结构与功能关系，应用芴甲氧 羰基 (Fm0c) 固相多肽化学合成方法合成 了用丙氨酸 (Ala)替代 JZTX—V第 12位赖氨酸残基 的突变体 K12A—JZTX — v，合成粗 品经反相高效液相色谱分离纯化和 MALDI—TOF质谱鉴定，证 明化学合成是成功的 ．线性多肽经谷胱甘 肽氧化复性后 ，复性产物经质谱测定其相对分子量为 3549．63，比线性分子的理论分子质量低 6，说 明六个半胱氨酸 已经配对形成 了三对二硫键 ． 关键词 ：敬钊缨毛蛛毒素 一v； 固相多肽合成 ； 突变体 ； 氧化复性 ； 质谱 中图分类号 ：Q25；Q343 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671—9743 (2008)05—0041—03 敬钊毒素 一V (Jingzhaotoxin—V，JZTX—V)是从 确定 Lysl2对 JZTX—V生物活性的影响奠定 了基础 我 国新发 现 的珍稀 蜘 蛛 敬钊 缨 毛 蛛 (Chilobrachys 1 材料与方法 fingzhao)…粗毒中纯化到的一种新型肽类神经毒素 ． 该毒 索 由 29个 氨基 酸 残 基组 成 ，其一 级 结 构 为 1．1 仪 器和 试 剂 YCQKWMWTCDSKRACCEGLRCKLWCRKII，其 中 6个半 9一芴 甲氧羰基 (Fmoc)氨基酸 ，二 甲基 甲酰胺 胱氨酸按照 l一4 (Cys2一Cys16)、2—5(Cys9一Cys21)、 (DMF)，HBTU，哌啶 (Piperidine)，三氟 乙酸 (TFA)， 3—6(Cys15一Cys25)的连接模式形成三对二硫键 ．电 RinkResin树脂均从吉尔生化有限公司购买；还原型谷 生理活性测定表 明，JZTX—V能够强有力抑制大 鼠背 胱甘肽 (GSH)，氧化型谷胱甘肽 (GSSG)均为 Sigma 根神经节 (DRG)细胞上的河豚毒素不敏感型 (们 一 公司产 品 ． R)与河豚毒素敏感型 (TTX—S)钠 电流，其 IC50值 PS3多肽 合 成 仪 (ProteinTechnologies)，Ultraflex 分别是 27．6nmol／L和 30．2nmol／L2j．鉴于河豚毒素不 MALDI—TOF／TOF质谱仪 (Bruker)． 敏感型钠通道只在外周感觉神经元中表达，而且抑制 1．2 突变体 的化学合成与分离纯化 此类通道能够产生明显的镇痛效果却没有类似 目前临 参照文献_4J的方法，利用 PS3多肽合成仪完成突 床镇痛药物的毒副作用L3J，因此 JZTX—v具有开发成 变体 K12A—JZTX—V的固相化学合成 ．称取 0．185g 新型镇痛药物 的医用前景 ．为 了进一步研究该毒素 的 (0．1mmol规模 )RinkResin酰胺树脂放入多肽合成室 结构与功