激光共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用.pdfVIP

医学生 激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用 文字表述：关键词： 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS） 　　摘 要 激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量 测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍 要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。 　　关键词 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS） applications. 图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见 光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在 亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学 、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3]，对生物样品进行定性 、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。 代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每 秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引 器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。 　　1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成 一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第 一代激光扫描共聚焦显微镜。 　　激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜， 变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样 品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚 焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。 　　从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不 能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜 为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像 还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。 终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积 最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图 像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。 一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应 的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高 清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。 　　2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统 示器。　　共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小； 平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统 高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。 件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择 较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定 台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。　 ，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。 　　3 激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用 　　3.1 定量荧光测量 　　ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞 群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜 电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确 监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定 量信息。 　　3.2 定量共聚焦图像分析 　　借助于ACAS 激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得 到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细 胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化