渗透胁迫相关基因高通量筛选技术体系的建立.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2008，28(6)：60～64 渗透胁迫相关基因高通量筛选技术体系的建立术 杨 靓 纪 巍 代翠红 朱延明 (东北农业大学生命科学学院 哈尔滨 150030) 摘要 随着功能基因组学的发展，在基因组水平上获得了大量渗透胁迫相关基因。农杆菌介导 的超量表达是筛选和鉴定这些基因功能最为常用的技术。以植物表达载体 pBI121为基础，在不 改变其氨基酸序列的基础上通过定点突变消除了其上与质粒复制和稳定性有关的 trfA基 因 (X00713)内部的 I酶切位点，并在表达单元CaMV35s启动子和NOS终止子之间引入了 IA 和 IB位点，改造成通用植物表达载体卡盒 pBHT一5。该载体卡盒可直接用于连接 Clontech SMARTMT技术构建的cDNA文库，提高了大规模构建cDNA文库基因植物表达载体的工作效率。 为高通量的筛选与鉴定基因功能，从大量的渗透胁迫相关基因中筛选出具有独立知识产权的、对 植物抗渗透胁迫起重要作用的新基因奠定了坚实的基础。 关键词 pBI121 渗透胁迫 SMART技术 基因功能分析 中图分类号 781 植物在生长发育过程 中经常受到低温、干旱及高 用 RNA 逆转录过程 中 5末端 的模板转换机制 盐等渗透胁迫条件的影响，导致作物严重减产、品质下 (SwitchingMechanismAt5endoftheRNATranscript， 降，这已经成为困扰我国乃至全球农业生产的重大问 SMART)来合成全长 cDNA，随后用 I消化dsDNA并 题。因此，世界各国都致力于从分子水平阐明抗渗透 将其插人 pTriplEx2构建全长 cDNA文库 的方法 胁迫机理及确定渗透调节关键基因。 (http：／／www．clontech．com／clontech／techinfo／manuals／ 近年来 ，植物渗透胁迫研究已进人后基因组时代。 PDF／PT3000-1．pdf)，以备广泛地应用于全长cDNA文 植物基因组测序工程使得人们获得了大量的基因序列 库的构建。 信息，但是这些基因的功能多数还是未知的。因此，现 pBll21是农杆菌介导的超量表达中最常用的植物表 今更为重要的任务是将其研究重点转移到对功能基因 达载体，但 由于其上与质粒复制和稳定性有关的trfA基 组和蛋 白质组的研究上 。目前通常的做法是构建 因(X00713)内部存在 I酶切位点，因此不能采用 I 胁迫处理全长cDNA文库 ，再利用 EST技术 、基因芯片 酶切 平 (切平)．连接的方法对pBI121进行改造使其 技术和生物信息学等策略高通量、大规模地筛选其中 适用于ClontechSMARTMT技术构建的cDNA文库。 渗透胁迫相关基因 ；然后通过研究基因的超量表达 本研究针对上述问题，通过PCR定点突变的方法 ， 能否提高转基因植物的抗逆性来对这些基因的功能作 消除了 pBI121／trfA基 因上 的 I酶切位点并在 出正确的评价。 CaMV35s启动子和 NOS终止子之 问引入了SfiIA和 SMART方法是 Clontech(BD)公司开发的一种利 IB位点，构建了通用植物表达载体卡盒pBHT-5，该 载体卡盒可用于构建所有采用 ClontechSMART 技术 收稿 日期：2008-02-22 修回日期 ：2008-03-24 国家科技部重大基础研究前期研究专项 (2003CCA03500)、国家 获得的全长基因(库)的植物表达载体 (库)，为建立高 自然 科学基金 、黑龙 江省科 技厅重 大攻 关项 目