人canstatin基因转化新型生物反应器——杜氏盐藻（Dunaliella salina）的初步研究.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2008，28(6)：55—59 人 canstatin基 因转化新型生物反应器 杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的初步研究木 冯书营 谷辉辉 刘红涛 薛乐勋 (郑州大学第一附属医院郑州大学医学实验中心 郑州 450052) 摘要 采用RT-PCR技术从人的胎盘组织中克隆canstatin基因，定向连接到表达载体puQ上，然 后与筛选标记bar盒连接得到真核表达载体pUO-Can-Bar。采用玻璃珠转化法将该表达载体转化 杜氏盐藻(以下简称盐藻)，通过草丁膦固体平板筛选得到转化株，进而对转化株进行阳性鉴定。 PCR结果显示，在盐藻转化株 中均能够扩增出约700bp特异的条带，而在阴性对照中没有扩增出 该条带。Southernblot结果进一步证明人 canstatin基因已经整合到盐藻细胞的基因组中。此外， 对盐藻转化株的遗传稳定性进行了分析，结果表明canstatin基因能够在转化藻株中稳定遗传。人 canstatin转基因盐藻株的成功制备为利用盐藻反应器大规模生产人 canstatin蛋 白提供 了实验依 据 ，为及早实现 canstatin蛋 白在治疗肿瘤上的临床应用提供 了前期工作基础。 关键词 人 canstatin 转化 新型反应器 杜 氏盐藻 中图分类号 Q819 自1971年Folkman 提出阻断新生血管的形成来 和微生物等反应器相比，具有成本低、高效低廉，为大 抑制肿瘤生长的观点以来，内源性血管生成抑制物的 规模生产外源性蛋 白提供了优越的条件保证 。另 研究成为肿瘤治疗研究领域 的热 点，如血管抑素 外，盐藻本身无毒无害，富含胡萝 卜素等营养物质，可 (angiostatin) 、内皮抑 素 (endostatin) 、休 眠素 直接作为一种天然的营养保健品 ，在此基础上引入 (restin) 和肿瘤抑素 (tumstatin)E52等一些抗血管生成 外源基因，能够得到多功能的转化藻株。但 目前盐藻 因子相继被鉴定。canstatin 是一种新发现的血管生 反应器的研究还处在初级阶段 ，虽有研究者对转化盐 成抑制因子，其抗肿瘤作用较内皮抑素强 ，治疗肿瘤有 藻进行了探索 ，但迄今未见利用该反应器大规模生 效剂量较血管抑素低…，显示出更好的应用前景。但 产外源性蛋 白的报道 。本研究创新性地将人 canstatin 目前有关 canstatln蛋 白生产研究报道较少，多见于原 基因通过转基因技术引入盐藻反应器，旨在制备能够 核系统的表达 ，也有真核表达 ¨ 的尝试 ，但均因 稳定高效表达人 canstatin蛋 白的多功能藻株。该盐藻 其产量低 、生产成本高，难 以大规模生产该蛋 白，远远 转化株的制备为生产治疗肿瘤的口服型药物进行了尝 不能满足于临床需要。为此 ，选择一个稳定高效的表 试，为满足临床肿瘤治疗的迫切需要提供了理论依据 达系统是 目前解决难以批量生产该蛋白难题的关键。 并奠定了工作基础。 盐藻 (Dunaliellasalina，D．salina)作为一种新型的 生物反应器 ，为大规模生产 canstatin蛋白提供了优 1 材料和方法 秀的条件基础和最佳结合点。盐藻本身属于真核生 物，能够产生