三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物初步研究.docVIP

三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物的初步研究 林 敏，潘伟斌*，张太平，李 燕，何鉴尧 华南理工大学环境科学与工程学院，广东 广州 510640 已知3株溶藻细菌L7、L8和L18的活性代谢产物具有明显的溶藻效果。为获得较高活性和浓度的目标产物，研究了培养基、碳源、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性。在牛肉膏蛋白胨、淀粉、查氏和高氏1号4种培养基里，淀粉培养基最适宜用于获得溶藻活性代谢产物。以淀粉培养基为基础，碳、氮源组合依次为淀粉+ (NH4)2SO4、淀粉+(NH4)2SO4，葡萄糖+ KNO3时，3株溶藻细菌的溶藻活性代谢产物溶藻活性最高。这一结果为目标产物的分离奠定了物质背景。3株溶藻细菌溶藻活性代谢产物均具有良好的热稳定性，经热处理后，对叶绿素a的去除率仍高于73%。L7的无菌滤液调至pH值4.0或2.5，2 h后丧失溶藻活性；L8和L18的无菌滤液调至pH值4.0，2 h后未丧失溶藻活性，调至pH值2.5，2 h后丧失溶藻活性。上述结果为溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。 富营养化溶藻细菌活性代谢产物中图分类号：X1 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2007）0-0358-05水体富营养化引起的藻类水华问题，带来各种危害[1-3]，其防治已成为环境领域的热点和难点。溶藻细菌作为水生生态系统的一部分，其溶藻作用引起众多关注[4-5]。部分溶藻细菌能够分泌胞外活性物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用[6-12]。利用溶藻细菌分离筛选高效、专一、绿色的溶藻活性代谢产物，最终开发高效、安全的杀藻剂已成为治理藻类水华问题的新思路[7]。目前，国内对溶藻细菌的研究处于起步阶段，对于细菌溶藻活性代谢产物的研究尚属空白。 本课题组从广州城区某富营养化池塘中分离筛选出3株溶藻细菌，初步研究表明，这些溶藻细菌分泌的活性代谢产物具有明显的溶藻效果，且在碱性条件下溶藻能力较强，利于水华治理。为获得较高活性和浓度的目标产物，也为便于后续的活性物质的分离纯化，研究了培养基、碳源、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物的保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性，为下一步溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。 实验用的3株溶藻细菌是本课题组从广州城区某富营养化池塘筛选获得，编号分别为L7、L8和L18。L7和L8菌株属蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；L18菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。各菌株在GenBank的登录号分别为DQ459876（strain L7）、DQ486872（strain L8）、DQ459877（strain L18）。 选用的藻种为蓝藻中的水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)，来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心。 ①牛肉膏蛋白胨液体培养基[]。②牛肉膏蛋白胨固体培养基：每100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基加入琼脂1.5～2.0 g③淀粉培养基：可溶性淀粉10 g，K2HPO4 1 g，NaCl 1 g，MgSO4?7H2O 1 g，(NH4)2SO4 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.0~7.2④查氏培养基[13]⑤高氏1号培养基[13]⑥蓝藻培养基BG11[14]。 接种细菌于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，在生化培养箱30℃培养24 h后，每个斜面用5~10 mL灭菌的液体培养基洗脱菌苔，置于30 ℃恒温振荡器中120 r·min-1，振荡4 d。然后在4 000 r·min-1条件下，离心15 min，收集上清液经0.22 μm微孔滤膜抽滤两次，平板涂布进行无菌检验，制成溶藻细菌无菌滤液（以下简称无菌滤液），pH值为6~6.5。 （1）藻种培养：藻种经活化后，在23±0.5) ℃，光照强度3 000 lx，光暗周期比14 h10 h条件下培养。 （2）溶藻试验：取预培养10 d且长势良好的水华鱼腥藻以11的比例加入无菌滤液中，设两个平行，置于人工气候箱中静置培养7 d。 （3）溶藻效果的判断：实验藻液中除水华鱼腥藻外，没有其他含叶绿素的植物，因此选用叶绿素a（Chla）含量的变化考察去除效果[15-17]。 （1）培养基以牛肉膏蛋白胨液体培养基、淀粉培养基、查氏培养基和高氏1号培养基等4种培养基分别培养细菌，制备无菌滤液，进行溶藻试验，判断溶藻效果。 （2）碳源以淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。 （3）氮源以(NH4)2SO4、KNO3、尿素、NH4NO3为氮源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。 以溶藻细菌细胞干物为生物量指标，表征细菌生长情况。取100 mL菌液（菌液的制备见1.2.1，其培养条件见1.2.3），4 000