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TA克隆的策略 对于亚克隆来说,酶切-连接可谓是最经典的方式。虽说效果不错,可着实有些麻烦。载体和片段 分别酶切、跑胶、回收,再加上连接和转化,一星期转眼就过去了。做表达的那是没办法,载体上只 有多克隆位点,那我们只能配合。对于只是想克隆保存或测序的同学来说,快速简便的 TA克隆则不失 为一个好选择。 TA 克隆的 idea 昀初来自 1994 年。几位学者 3. 立即进行纯化,沉淀、跑胶、或用纯化试剂 发现 Taq DNA聚合酶会在 PCR产物的 3’末端加上 盒。这一点相当重要,否则高保真聚合酶会将 A 一个脱氧腺苷(A),而且这种特性与模板无关。 尾巴或 T 载体上的 T 尾巴切掉。 之后,Invitrogen 公司发明了 TA 克隆技术,并拥 有些高效率的聚合酶其实是 Taq 酶和高保真 有全球 TA cloning商标的专利权,直至 2013 年。 酶的混合物,大约有一半的产物加了 A 尾巴。所 (这个就够他们赚得盆满钵满了。)线性化的 T 载 以你在克隆之前昀好搞清楚你用的酶到底是否加 体在 3’末端拥有一个脱氧胸苷(T) ,与 PCR产物 A,否则克隆出来白斑太少,又要讨论好久。 的 A 尾巴互补。原理就是这么简单。不过由于价 PCR产物的纯度 格的原因,Invitrogen 的 T 载体在国内却不是销量 昀好的。 Promega 的 pGEM-T(easy)和 Takara 如果你的 PCR 产物只有唯一条带,恭喜你。 的 pMD18-T 因性价比高,更加深入人心。 不过为保险起见,昀好还是用 PCR 产物纯化试剂 盒来纯化一次。否则白色菌落中的插入片段可能是 TA 克隆的步骤无需赘述,相信大家都很清楚。 引物二聚体哦。如果你发现有非特异条带,那昀好 无非就是 PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤, 优化一下 PCR 反应,让非特异条带消失。跑胶纯 不过还有一些不得不说的问题,值得大家注意。 化是下策,因为胶纯化可能会带走 3’的 A 尾巴。 用什么样的聚合酶? 而且注意不要在紫外灯下暴露太久。只需 5秒,紫 不是所有的聚合酶都会在PCR产物末端加A。 外对 DNA 的伤害就足以检测;而长达 60 秒的照 具有 3’到 5’外切酶活性的高保真酶就不会产生 A 射会让某段序列在测序时无法读取。问题远比你想 尾巴。如果你下一步想要做基因表达,一定要用高 象中严重。 保真酶,那也没问题。只要用 Taq酶在产物末端加 生物通提示:PCR 产物其实也有保质期。为 个 A 就 OK。步骤也很简单,根本无需买个什么加 了保证连接效率,PCR 产物昀好不要超过一天。 A 试剂盒,几步就搞定了。 因为上面的 A 尾巴会随着时间逐渐降解,导致连 1. 用高保真酶扩增完之后,在反应管中加入 接效率下降。千万不要为了省事,就整个一大管 0.7-1 unit 的 Taq 聚合酶。无需更换 buffer,其中 PCR产物,每次用一点。昀终反而更浪费时间。 的 dATP 已经够用。 载体和片段的比例 2. 在 72℃孵育 8-10 分钟。 这往往是影响克隆效果的昀大因素。通常来 第 1 页,共 18 页 下一页返回说,载体与片段的起始摩尔比为 1:1。计算方法 八次之后,才想起阳性对照。浪费了时间不说,如 如下: 果你的样品很珍贵,那谁也无力回天。一般说来, 起码有 60%以上的菌落应该是白色的。 X ng PCR产物 (ng 载体 × kb 片段大小) / kb 载体大小 自连对照 如果这样的比例不能令你满意,你可以在 3: 这个对照是检验 T 载体的 T 尾巴是否还在。 1 到 1:3 的范围内进行优化,选择昀佳的比例。 如果转化后出现大量菌落,这个 T 载体一定有问 PCR 产物的浓度可以通过与 Marker 比对估算出 题。 来。还有一种更准确的方法,用 GE 的 NanoVue 转化对照 超微量分光光度计。只需要 0.5 ul,就能测量出样 每一次转化实验都应该设立对照。自家制备感 品浓度,你再也不用舍不得珍贵的样品了。0.5 ul 受态细胞是这样,购买现成的感受态更是这样。因 而已,小意思。 为感受态细胞非常敏感,绝对不能冻融。从外地长 对照 途运输过来,谁知道中途发生过什么事。为保险起 托尔斯泰曾说过:“幸福的家庭总是相似的, 见,一定要转化一个环状的质粒(非 T 载体,因为 不幸的家庭各有各的不幸。”实验也是如此。失败 它们已经线性化了)作为对照。如果没有看到密密 的实验总有各种各样的缘由。对照在实验失败时就 麻麻的菌落,这个感受态基本就是不合格的。 凸显其重要性了。 TA 克隆的效率主要与片段长短有关,片段越 阳性对照 长,效率越低。一般的 TA 克隆试剂盒适用于 3kb