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遗传病的分析5DNA扩增产物的鉴定 限制性内切酶酶切技术 琼脂糖凝胶电泳技术 一、限制性内切酶酶切技术 原 理 限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的特异序列（一般识别4－6个核苷酸序列） 由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。 原 理 本实验使用限制性内切酶（Lwe I） ，酶切位点： 5′….GCATC(N)5↓…3′ 3′….CGTAG(N)9↑….5′ 正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是１个片断。 器材与试剂 高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等 Lwe I限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等 操 作 1、取样品2份（病人、正常人PCR扩增产物） 无菌ddH2O 14ul 缓冲液10× 2ul 扩增产物 3.5ul 内切酶 0.5ul 2、置37oC水浴3h（或过夜） 注意事项 内切酶需在－20℃环境中保存。 内切酶活性的发挥需要Mg2＋ 。 为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。 二、琼脂糖凝胶电泳技术 原 理 溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA。EB用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD 摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。 一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在TAE介质溶液中，进行电泳。由于电场作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。此时用紫外透射仪可以检测之。 以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大小。 器材与试剂 紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、 移液枪、枪头、塑料离心管等 1％琼脂糖（含EB）、 DNA样品、标准Marker、 溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等 操 作 1、制备1%凝胶板： 配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60 ℃时，浇板； 冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。 2、制备上样样品3份（Marker、病人及正常人酶切产物）： 每份样品在塑料薄膜上加： 溴酚蓝溶液 6 × 1ul 样品 ５ul 3、点样： 吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。 4、电泳： 接通电源（80mA），约30min。 5、鉴定： 取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。 结 果 注意事项 溴化乙啶（EB）是强诱变剂， 具有高致癌性！ 定义： 细胞培养 细胞分裂指数 细胞活率 细胞的生长曲线 细胞周期 细胞培养的生命周期 细胞系、细胞株 细胞“代” 微核 系谱分析 * * 20ul混匀    混匀