重组人uPA_（17）-KPI在毕赤酵母中的表达及鉴定.pdfVIP

虫国实验诊断学 2010年 l1月 第 l4卷 第 11期 — 1685 一 文章编号 ：1007—4287(2010)11—1685—04 重组人 uPA17一KPI在毕赤酵母 中的表达及鉴定 赵 磊 ，颜炜群 (吉林大学药学院生物工程教研室，吉林 长春 130021) 摘要：目的 研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase—typeplasminogenactivator，uPA)一Kunitz型丝氨酸蛋 白 酶抑制剂(Kunitzproteaseinhibitor，KPI)融合蛋 白在毕赤酵母中分泌表达的条件。方法 利用 已构建的KPI—pPICZaC毕 赤酵母表达载体，人工合成 uPA17，利用基因重组技术构建uPA”lKPI—pPICZ~C表达载体。电转化毕赤酵母菌X-33，PCR 法筛选阳性克隆，分别用 SDS、胰蛋白酶抑制实验分析鉴定发酵产物。结果 酶切鉴定和DNA测序证实，成功 构建 uPA”-KPI-pPIC7~C表达载体。SDS分析在相对分子质量约8800处出现 目的条带，摇瓶水平诱导表达 120h 表达量达到高峰，含量可达 50mg／L。表达产物具有胰蛋 白酶抑制活性。结论 本研究在毕赤酵母中成功表达 uPA KPI融合蛋 白。 关键词：尿激酶型纤溶酶原激活剂；Kunitz型丝氨酸蛋 白酶抑制剂 ；毕赤酵母 中图分类号：Q7 文献标识码：A ExpressionandidentificationofrecombinanthumanuPA17-KPIinPichiapastoris ZHAOLei，YANWei-qun ．(Departmentof Bioengineering，SchoolofPharmace~icalSciencesof inUniversity，Changchun13(1021，China) Abstract：Objective Toexplorethemethodofsecretoryexpressionofrecombinanthumanurokinase--typeplasminogenactiva-· tor-Kunitzproteaseinhibitor(1hDAI7-KPI)inPichiapastofis．Methods OnthebasisofKPI—pPICZuC，weconstructedhterhuPA17一 KPI—pPICZaCeukaryonexpressionvectorthroughgenerecombinanttechnology．Therecomb inantplasmidwastransformedintoPichia pastorisX-33viaelectroporation．ThetrnasformedpositivestrainswerescreenedbyPCR．Thesupematantwerenaalyzed bySDS- PAGEnadtrypsininhibitionexperimenttoscreenfermentationsupematant．Results Aftercorrespondingenzymecuttingidentification andDNA sequencingproving，weconfimr edthatuPAl7一KPI—pPICZaCwassuccessfullyconstructed．SDSshowedthathterelative molecularmassoffemrentationproductwasabout8800．Afterinductionwithmehtanolfor120h，theyieldofuPA17一KPIcouldbe50 mg／L．uPA17一KPIhadtheactivityoftrypsin inhibition．Conclusion Pichiapastoriscan expressfusionprotein ofuPAl7一KPIeft iciendy． Keywords：urokinase—typeplasmino