大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立.pdfVIP

第 l7卷 第6期 中国水产科学 V0l1．17 NO．6 2010年 11月 JournalofFisherySciencesofChina November 2010 大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及 PCR快速检测方法 的建立 马冬梅，白俊杰，邓国成，李胜杰，叶星，江小燕 (中国水产科学研究院 珠江水产研究所，中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室，广东 广州 510380) 摘要：为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大 口黑鲈 (Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征，本 研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus，LBUSV)主 要衣壳蛋 白(MCP)基因，该基因编码区全长 1392bp。通过序列比较分析，在MCP基因内确定了一段 241bp的特 异性较强的片段作为靶序列，设计并合成引物，经过优化 PCR反应条件，建立了可以快速检测大 口黑鲈溃疡综 合征病毒的PCR方法。实验表明，在 PCR进行到 3O个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是 10拷贝数／a!L， 相当于 10个病毒粒子。利用该方法，从天然感染 LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出24lbp的片段，而 健康大 口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检 测方法具有检测快速、成本低 、准确性高的特点，适用于大范围早期病害诊断的推广应用 。 【中国水产科学， 2010，17(6)：l149-11561 关键词：大口黑鲈溃疡综合征病毒；大口黑鲈；虹彩病毒；主要衣壳蛋白；序列分析；PCR检测 中图分类号：$94 文献标识码：A 文章编号：1005—8737一(2010)06—1149—08 大 口黑鲈(Micropterussalmoides)，俗名加州 名为大 口黑鲈溃疡综合征病毒 (Largemouthbass 鲈，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和容易起捕 ulcerativesyndromevirusLBUSV)。目前这种病毒 等特点，从 20世纪 7O年代开始推广到世界各 病还没有有效的治疗方法，所以对该病的早期快 地，中国目前大口黑鲈的年产量约为 l0万tL1 。但 速诊断，确定病原成为重要的防治手段 。 2006—2008年的每年6—10月期间，一种溃疡综合征 虹彩病毒的一个主要特征是具有直径 120～ 在广东省的养殖大 口黑鲈中流行，而且有逐年加重 300nm 的二十面体衣壳结构 4【J，由一种分子量约 的趋势。感染病毒的鱼发病时皮肤和肌肉溃烂，脾 50kD的主要衣壳蛋 白(majorcapsidprotein，MCP) 脏和肾脏变大，病鱼死亡率最高达 60％l3】，给养殖 组成，该结构蛋 白占病毒总蛋 白量 的 40％～ 45％ 5【J 者造成了巨大的损失，已对大 口黑鲈养殖产业构 。 由于MCP的氨基酸序列同源性可以反映 成了严重威胁。2008年，邓国成等[31从病鱼中成 不同虹彩病毒之间的亲缘关系，因此该基因被视 功分离到一种病毒，经回归感染确认该病毒就是 为研究虹彩病毒分子进化的依据I6J。 导致溃疡综合征的病原，经电镜观察和 DNA 序 本研究用基因组步移的方法获得 了 LBUSV 列分析，确定了该病毒的分类地位为虹彩病毒科 的MCP基因编码区全长及其上下游序列，并根据 (Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，并将该病毒命 MCP基因的不保守区域设计并合成了一对引物， 收稿 日期：2010—04—23；修订 日期：2010—05—06． 基金项 目：国家科技支撑项 目(2006BAD01A1209)；广东省科技计划项 目(2o07BO2O708O