a-L-岩藻糖苷底物测定AFU酶活的评估[点击查看文档].docVIP

a-L-岩藻糖苷底物测定AFU酶活的评估 元升生物科技技术研发部 1概述a-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase，AFU)的分类名为a-L-岩藻糖苷酶水解酶(EC3．2．1．51），催化岩藻糖苷键水解，参与含岩藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖脂的分解代谢。AFU合成于细胞内，定位于溶酶体，是一种酸性水解酶，它的本质是糖蛋白。广泛分布于人体肝、肾、胰、脑和胎盘等组织以及血清、尿液、唾液和泪液中。AFU在人体内呈多形性，在等电聚焦电泳中AFU 可分出5～9条区带，血清中AFU除含有PI为4．68和4．84两种主要成分以外，还可见到5个次要成分。AFU具有3型同工酶，即AFU1、AFU2和AFU3，是由1个位于第一号染色体短臂（1p34）上基因位点的2个等位基因所表达，由于不同人所表达的同工酶类型不同，所以正常人群AFU活性也有所不同，大约有10%左右的正常人血浆AFU呈低活性。测定a-L-岩藻糖苷酶(a-L-Fucosidase,AFU)对诊断原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是PHC的特异性标志物,可用于PHC的早期诊断. a-L-岩藻糖苷酶酶作用下，生成产物CPNP，而产物CPNP的生成量与样本中AFU的酶活性成正比，通过测定黄色产物在405nm波长的生成速率，即可计算出样本中AFU的活性。 3 实验方法 3.1 样本 瑞安市人民医院临床新鲜血清样品。 3.2 仪器和试剂 CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生产，批号1213M05QH。进口底物购自美国sigma公司，批号1013C07QH；仪器为日立7080全自动生化分析仪、抗坏血酸、胆红素、人胎盘a-L-岩藻糖苷酶均购自sigma公司，血红蛋白标准品购自上海血液中心。 3.3 试剂配制方法 .4 测定方法 HITACHI 700自动分析仪参数 反应类型：法；反应温度：37℃；波长：(主)/(次)nm；样本：μl，0μl， 4.1 精密度评价 按NCCLS评价方案，取低、中、高三个不同浓度的样本，上下午双份测定，连续测20d，1次，共测20d，结果见表1 表1 批内和批间精密度测定结果(U/L) 样本 标本 次数 批 内 次数 批 间 x SD CV% x SD CV% 1 2 3 低值 20 25 0.55 2.20 20 25 0.60 2.40 中值 20 68 0.78 1.15 20 68 1.02 1.5 高值 20 235 2.26 0.96 20 235 2.82 1.2 4.2 线性范围评价 按NCCLS的评价方案，选用购自sigma公司人胎盘a-L-岩藻糖苷酶为300U/L和20U/L的高低值酶样本2份，然后2份样本等量混合产生中间值160U/L，中间值再与高低值等量混合，产生230U/L和90U／L的5个不同梯度值样本，在仪器上以低值到高值和高值到低值分别测定，求得两次平均值，以X作为理论值，Y作为测定值进行回归分析，其方程Y=0.9986X-0.3714,r=0.9994。表明AFU活性在300U/L范围内，线性良好。 4.3 比对实验 取浓度从～/L的不同病人新鲜血清标本50份，分别用本同时数据均按NCCLS文件统计，t检验得P0.05，y=0.9813X-0.3746;r=0.9991,表明本试剂与进口试剂高度相关。 4.4 回收实验 向250μl血清中加入50μl的生理盐水作为基础样本，测得AFU浓度为20U/L，向同体积的血清标本中分别加入50μl浓度为25U/L和80U/L的AFU酶标准品，使其终浓度分别为24.2U/L和33.3U/L的样本,每一浓度作平行管，测得其回收率为98.5％～102.4%. 4.5 干扰试验 在高、低两个浓度的混合血清样本中分别加入不同浓度的胆红素、血红蛋白、抗坏血酸（VitC），然合对AFU进行测定，结果表明三酰甘油≤5.0mmol/L、Hb≤2.5g/L、 胆红素≤500μmol/L、VitC≤10g/L时经配对差异比较，均无显著干扰(P0.05)。而常用抗凝剂中EDTA.K2、草酸钠对检测无显著干扰，但肝素明显干扰AFU的检测，使AFU结果出现假性偏高，其干扰机理尚不清楚。 5 结论 本公司合成的CNP-AFU底物法用于检测AFU活性较为理想，该底物在酸性条件下，样本中的AFU将含呈色基团的底物CNP-AFU的1，4位糖苷键水解，使反应在405nm处产生最大吸光度，通过测定吸光度的变化，