高灵敏CdTe量子点探针的构建及与金属离子的作用.pdfVIP

Vol.33 高等 学校 化 学 学报 No.11 2012年11月 摇 摇 摇 摇 摇 摇 CHEMICALJOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES摇 摇 摇 摇 摇 摇 2486~2491 基基于定点突变的抗克百威单链 抗体的亲和力成熟 邓摇 龙, 肖治理,董洁娴,王摇 弘,杨武英,谢摇 曦, 杨金易,沈玉栋,孙远明 (广东省食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品质量与安全研究所,广州510642) 摘要摇 为获得亲和力更高的抗克百威(CBF)单链抗体(scFv),从抗CBF scFv氨基酸序列出发,通过同源模 建获得抗体模型,找出抗体中的活性口袋区域,进而将小分子药物与抗体进行分子对接,发现疏水作用和氢 键对于抗体亲和力具有重要作用. 进一步对口袋内亲水氨基酸残基HArg40 和LHis38进行模拟替换,再进行 分子对接分析,发现当以亮氨酸为突变氨基酸时,对接评分最高. 在此基础上,通过构建突变scFv基因及可 溶性表达,采用ELISA法对进化后的单链抗体(evoscFv)进行了鉴定. 结果表明,evoscFv对CBF 的IC 值为 50 -8 18郾11 滋g/ L,低于野生型抗体的27郾25 滋g/ L,亲和解离常数K 为4郾06伊10 mol/ L,相对亲和力比野生型 d scFv提高了2郾23倍,说明通过分子对接分析及对抗体活性口袋中氨基酸残基进行替换,获得了一个亲和力 更高的突变体抗体. 关键词摇 克百威;单链抗体;分子对接;定点突变;亲和力成熟 中图分类号摇 O629摇 摇 摇 摇 文献标识码摇 A摇 摇 摇 摇 doi:10.7503/ cjc 克百威(Carbofuran,CBF)是一种高效、广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂,国家农药残留标准中规定其 在粮食和蔬菜中不得检出. 免疫分析方法现已被用于CBF 的快速检测[1~5] ,而进行免疫分析的基础是 获得高质量的抗体. 基于基因工程抗体的优越性,可通过对抗体三维模型进行合理设计,根据需要引 入突变或对基因序列加以改造,筛选出符合进化方向的抗体,从而改进抗体的特性[6~9]. 抗体亲和力的高低是决定其实际应用价值的重要因素之一. 目前,提高抗体亲和力的方法多采用 错配法等手段将抗体基因进行随机突变,利用噬菌体或细菌表面呈现技术构建突变体抗体库,然后进 行筛选[10,11] ,但是此方法的缺点是随意性大. 近年来,借助计算机模拟技术,通过同源模建获取抗体 模型并分析抗原抗体结合活性位点,探究抗原与抗体之间的相互作用,并对抗体的氨基酸序列进行修 改以提高抗体亲和力已经成为一种重要的手段[12~14]. 本文采用计算机模拟技术,在分子对接基础上研究了配体与受体的相互作用机制[15~18] ,对活性 口袋内的氨基酸进行模拟替换获得了亲和力更高的抗体氨基酸序列,进而采用重组技术对原有scFv 基因片段进行定点突变,构建可溶性表达载体,诱导表达后,对改造的单链抗体(Single chain Fv, scFv)进行了活性验证. 1摇 实验部分 1.1摇 材摇 摇 料 [19] 1.1.1摇 质粒和菌株摇 pCANTAB5E鄄scFv 质粒 (含抗 CBF scFv 序列)及 pLIP6/ GN鄄scFv 质粒(含抗 CBF scFv序列)由本实验室构建并保存;大肠杆菌BL21(DE3)plySs 由本实验室保存;pLIP6/ GN载体 系 Dr. Fr佴d佴ric Ducancel(Pharmacology and Immunoanalysis Department, CEA/ Saclay, Gif鄄sur鄄Yve