鸡肝碱性磷酸酶提取及在线固定化研究.pdfVIP

第 34卷第 2期 辽宁师范大学学报(自然科学fi) Vo1．34 No．2 2011年 6月 JournalofLiaoningNormalUniversity (NaturalScienceEdition) jun． 2011 文章编号 ：1000—17352【011)02—0206—03 鸡肝碱性磷酸酶提取及在线固定化研究 杨 梅， 张 强， 王 欢， 徐 芬， 孙 彤 (辽宁师范大学化学化工学院，辽宁 大连 116029) 摘 要 ：分别用有机溶剂沉淀法和盐析法从大骨鸡肝中提取出碱性磷酸酶，并考察了提取酶液的酶促反应动力学性 质．在此基础上，利用顺序注射系统将提取酶在线固定于XC～72导电炭黑表面，制备了固定化碱性磷酸酶．结果表 明，大骨鸡肝碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠分解的最佳 pH=10．8，最适温度为 50℃，米氏常数为 1．62mmol／L．相 比 游离酶，所得固定化酶的比活力显著提高． 关键词 ：碱性磷酸酶 ；大骨鸡 ；顺序注射 ；在线 固定化 中图分类号 ：O657．3 文献标识码 ：A 碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，EC3．1J3．1，简称AKP或ALP)，是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存 在于人体、动物、植物及微生物体 内[1]．由于碱性磷酸酶在生物的磷酸基团代谢和转化中发挥着重要作用，所 以人体碱性 磷酸酶水平在临床医学上被作为诊断骨骼及肝脏类疾病的重要指标[2]，而从各种动植物、微生物中提取的碱性磷酸酶被 广泛应用于酶联免疫、生物传感、分子生物学领域的研究[3]． 商品化碱性磷酸酶主要提取 自牛小肠 、麦芽以及大肠杆菌等 [1“]，也有用鸡组织来提取碱性磷酸酶的相关报道[．为 了提高酶的活性、稳定性和循环使用率，碱性磷酸酶的固定化已成为 目前的研究热点 ．笔者在前人工作基础上，用大 骨鸡肝作为酶源，分别用有机溶剂沉淀法和盐析法提取碱性磷酸酶，并且利用已构建的顺序注射一紫外可见分光光度系 统[8]，以XC--72／PVC为载体，对碱性磷酸酶的在线固定化以及固定前后酶比活性进行了初步研究和比较． 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 组织匀浆器；高速离心机 KDC一16H(科大创新股份中佳分公司)；UV一24O紫外可见分光光度计 (Shimadzu，日 本)；721可见分光光度计 (上海第三分析仪器厂)；双向注射泵(Cavro，Sunnyvale，加拿大)；六位选择阀(Valeo，美国)． 0．05mol／L的Tris—HAc缓冲溶液 (含 0．01mol／L醋酸镁，pH一8．8)；正丁醇；丙酮；无水乙醇；牛血清 白蛋白BSA； 4一氨基安替 比林 ；磷酸苯二钠 ；铁氰化钾 ；苯酚等．本实验所用试剂 皆为分析纯，水为二次蒸馏水． 复合材料 XC一72／PVC：取 XC一72导电炭黑(美国卡波特)1．0g用混酸(22．5mL浓 HNO。+7．5mL浓 HzSO4) 浸渍室温超声振荡 6h，抽滤，二次水洗至中性．自然干燥后，按质量 比1：5与PVC微球混匀搅拌，使 XC一72担载于 PVC表面 ，制成 XC一72／PVC复合载体材料． 1．2 实验方法 1．2．1 ALP提取 将新鲜大骨鸡鸡肝除去结缔组织 ，先用 0．01mol／L醋酸镁一醋酸钠溶液清洗干净，再称取 2．5g鸡 肝，切碎置于匀浆器中，冰水浴匀浆 30min，取匀浆液于离心管中在低温高速离心机中离心(8000r／min)2Orain，取上清 液备用．分别用有机溶剂沉淀法和盐析法[g提取ALP，所得粗酶蛋 白溶解于pH=8．8的Tris—HAe缓冲溶液，一2O℃保 存待用． 1．2．2 蛋白含量和酶活性测定 蛋白含量的测定采用紫外分光光度法：用牛血清 白蛋白作为基准蛋白，以280nm处的 紫外吸收光度值对粗酶提取液中的总蛋白进行定量 ；实际蛋白含量采用如下校正公式[1。]计算： 蛋 白质浓度 c(mg／mL)一1．5A28o 一O．75Az6o ALP比活力的测定采用金 氏法 [1”：以磷酸苯二钠为底物，4一氨基安替比林和铁氰化钾为显色剂，在 510nm波长处 测定吸光度．规定 37℃时，单位时间产生 lgmoL酚的酶量为 1个活力单位 (U)．ALP的比活力采用蛋 白单位