芭蕉属植物内生细菌的分离鉴定与分布特性研究.docVIP

芭蕉属植物内生细菌福建省农科院农业生物资源研究所，福建 福州 350003摘要：Sherlock MIS微生物自动鉴定系统关键词：Distribution of endophytic bacteria from Musa plants CHEN Lu, XIAO Rong-feng, SHI Huai, LAN Jiang-lin, LIU Bo* (Agricultural Bioresource Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，China) Abstract：ndophytic bacteria were isolated from ten different sites of four kinds of Musa plants, and identified by fatty-acid technology in Sherlock MIS. The species and the quantity distribution of endophytic bacteria were studied. Only 23 endophytic bacteria could were determined their species name, were classified into 14 species and 11 genera. Keywords：Musa Endophyte; Fatty-acid identification; Distribution 植物内生细菌是指其生活史的某一个阶段或整个阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞问隙，并且正常情况下它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌[1,2]。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种，分别属于54个属。主要的属有：芽孢杆菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属、肠杆菌属及短小杆菌属等。近年来，利用内生细菌进行植物病害的生物防治已经成为人们研究的热点。植物内生细菌生防机制主要有产生抗生素、竞争生态位和营养、诱导寄主产生系统抗性、灭活病菌萌发因子、产生胞外酶溶解病原菌细胞壁和降解毒素等几种方式。植物内生细菌可能具有宿主特异性，且在宿主不同器官中，其类群数量消长动态各有不同[5]。了解内生细菌的分布规律对有效地利用内生细菌防治植物病害具有重要意义。传统微生物鉴定方法大多操作步骤复杂、费时、成本较高，因此对其他鉴定方法的研究和开发越来越受到重视。脂肪酸是微生物细胞组分中一种稳定而富有的重要成分[6]。现代微生物学研究表明：细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸（fatty acid）成分与细菌的DNA具有高度的同源性，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱[7]。因此它的种类和含量是细胞化分类法的重要依据之一。Sherlock MIS微生物自动鉴定系统（美国MIDI公司开发）是一种商业化的微生物脂肪酸气相色谱分析系统，有一套完整的标准化程序，具有分析周期短、操作简单、准确度高等优点，实验成本也相对较低。该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2 200种[8]。目前国内外已有将Sherlock MIS应用于微生物鉴定的报道。(香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、香蕉黄叶病，是蕉的一种毁灭性病害，也是国际检疫对象。目前利用内生细菌防治香蕉的研究报道极少。本研究通过对内生细菌的分离、脂肪酸鉴定及数量分布分析，为进一步筛选拮抗菌株、其防病机理奠定基础。 1.材料和方法1.1 供试材料 植株样品：福州北峰的发育完整的健康福州野生蕉苗植株；三明顺昌蛟溪的发育完整的野生芭蕉苗植株；福建农林大学西区招待所附近绿化带的发育完整的红花蕉植株；漳州市南靖县龙山镇永北村的田间栽培的发育完整的威廉斯蕉植株。培养基NA固体培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.4脂肪酸提取处理试剂：TSBA培养基：30 g胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic soy broth，TSB）+15 g琼脂+1 L水（TSB购于Fisher公司）。皂化试剂：氢氧化钠45 g+甲醇150 mL+水150mL；甲基化试剂：6N盐酸325 mL+甲醇275 mL；萃取试剂：正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL；洗涤试剂：氢氧化钠10.8 g+水900 mL（配制方法由MIDI公司提供）。气相色谱系统：美国Agilent 6890N型。美国MIDI公司开发的基于细胞脂肪酸成分鉴定Sherlock MIS4.5（Microbial Identifi