Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立.pdfVIP

· 612 · 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2008Dec；43(6) Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立 朱恒锐 ，汪云飞 ，张庆慧 ，武 标 ，邢 听 ，刘晓颖 ，范礼斌 摘要 目的 建立稳定表达 Sedlin蛋白的细胞株，研究Sed— 为以后对Sedlin蛋 白在细胞 内具体功能的深入研究 lin蛋白在细胞内的分布。方法 扩增 SEDL基 因全长编码 奠定了基础 。 序列，经双酶切后克隆至真核表达载体 pCDGFP中，将重组 表达质粒转染至 HEK293细胞，用 G418筛选阳性克隆，荧 1 材料与方法 光显微镜和 Western blot检测 Sedlin蛋 白的表达 ，并观察 1．1 试剂 PCR引物合成和测序均 由上海生工生 Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果 经测序鉴定 ， 物工程技术有限公司完成；Taq酶为TaKaRa产品； 成功构建了SEDL基因的真核表达载体，转染 HEK293细胞 后，Westernblot检测，证明SEDL基因能够稳定有效的表达 ， 各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、小牛肠碱性磷 荧光观察显示，Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。 酸酶、胶回收试剂盒购 自北京道普生物有限公司；质 结论 成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株，Sedlin蛋 粒中提试剂盒购 自QIGEN公司；DNAMarker为 白广泛分布于整个细胞中。 Fermentas公司产品；DMEM完全培养基、胎牛血清 主题词 基因表达；转染 ；蛋白质类；细胞株 (FBS)、Opti—MEM均购 自Hyclone公司；转染试剂 自由词 Sedlin；脊椎骨骨骺发育不良 Lipofectamine2000购 自Invitrogen公司；G418为 中图分类号 R394．2 Amresco公司产品；GFP抗体购 自SantaCruz公司； 文献标识码 A 文章编号 1000—1492(2008)06—0612—04 ECL显色试剂盒为 Pierce公司产品；DAPI(4，6一di- amidino-2一phenylindole)购 自Sigma公司。 脊椎骨骨骺发育不 良(sp0ndyloepiphysealdys- 1．2 方法 plasiatarda，SEDT)是一种 x连锁 的隐性遗传 1．2．1 pCDGFP．SEDL质粒的构建 以含有人 病 ¨I2j，临床特征可归纳为：躯干特别短，通常臂长 SEDL基因全长编码序列的质粒pAS．SEDL为模板， 大于身高；脊椎骨变形缩短，并导致桶状胸，脊椎后 PCR扩增 SEDL基 因片段，插入 pCDGFP载体的 侧凸出；脊椎和骸部的变化在 10～14岁最为明显； BamHI和EcoRI双酶切位点，构建 SEDL基因的 易发生骸部的骨炎；患者通常带有不明的背痛，身高 真核表达载体。PCR引物分别为正向引物：5=CGG 增长呈下降趋势。该病患者皆为男性，女性携带者 GAT CCC GCC GCCACCATG TCT GGA AGC TFC． 一 般无症状或症状轻微 J。导致SEDT的基因命