c-Src结构域真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

第 41卷 第 5期 河南大学学报 (自然科学版) V01．41 NO．5 2011年 9月 JournalofHenanUniversity(NaturalScience) Sep．2011 c—Src结构域真核表达载体 的构建及鉴定 张瑶楠 ，石 冲 ，马永超 ，王泽生 ，张玉祥 (首都医科大学 基础 医学院生物化 学与分子生物学系 ，北 京 100069) 摘 要 ：通过聚合酶链式反应 (PCR)，将 c—Src的三个结构域 SH3、SH2和 KD分别定向克隆至 C端带有 HA蛋 白 标签序列的真核表达载体 pcDNA3中．经 HindlII和 XbaI双酶切分析和测序鉴定正确后，应用脂质体法转染 HeLa细胞 48h，蛋 白免疫印迹法可 以检测到细胞 内SH3、SH2和 KD的表达 ，证 明重组表达质粒 pcDNA3一SH2、 pcDNA3一SH3和 pcDNA3一KD构建成功，为进一步研究 Src激酶在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础． 关键词 ：Src；SH3；SH2；KD；真核表达载体 中图分类号 ：Q782 文献标志码 ：A 文章编 号 ：1003—4978(2011)05～0500—05 Construction andIdentification oftheEukaryotic Expression Vectorofc-SrcDomains ZHANG Yao—nan，SH IChong，M A Yong—chao，WANG Ze—sheng，ZHANG Yu—xiang (DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，FoundationMedicalCollege， CapitalMeaicazUnlversify，Beljlng 100069．China Abstract：PolymerasechainreactionfPCR)wasperformedtOobtaintheDNA fragmentsencodingthethreedomains ofC-SrcnamedSH2．SH3andKD respectively．TheDNA fragmentswereinserted into thepcDNA3vectorsin- framewiththeHA sequence And thenew constructswereconfirmed byrestrictionenzymedigestion and DNA sequencing．HeLacellsweretransfectedwiththepcDNA3一SH3，pcDNA3一SH2，pcDNA3一KDvectorsandpcDNA3 vectorrespectively．TheexpressionsofSH3．SH2 and KD weredetected byW estern blotting．Theeukaryotic expressionvectorspcDNA3一SH3，pcDNA3SH2andpcDNA3～KD wereconstructedsuccessfully．Thisstudy laida foundationfortheresearch on themechanism ofSrcprotein tyrosinekinaseintumorigenesisanddevelopmentof humancancers． Keywords：Src；SH3；SH2；KD；eukaryoticexpressionvector 0 引言 目前为止 ，共发现了 9个非受体酪氨酸蛋 白激酶 (nonreceptortyrosinekinase，nRTK)家庭成员，即 Src、Lyn、Fyn、Lck、Hck、Fgr、Blk、Yes和 Yrk．分析 比较 Src家庭成员 的结构 ，发现它们具有三个保守的结