农杆菌介导草酸氧化酶基因转入油菜.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 一 73一 农杆菌介导草酸氧化酶基因转入油菜 何晓兰，刘桂华，吴敬音，薛启汉，倪万潮 (江苏省农业科学院农业生物技术研究所，江苏南京210014) 摘要：以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体材料，运用农杆菌介导法进行草酸氧化酶(oxalateoxidase，germin)基因的转化，卡那霉素 抗性筛选和PCR测定结果表明，其中3株genninl、germin2及germin6呈阳性。T。代卡那霉素抗性筛选显示，germinl呈现3：1典型的 孟德尔单基因显性遗传，且在 T1代获得纯合株系。T代盛花期茎秆菌核病活体接种结果证实，转基因植株后代菌核病抗性得到明显 提高。证实germin基因已转入油菜植株中并得到有效表达。 关键词：甘蓝型油菜 ；草酸氧化酶基因；农杆菌介导法 ；菌核病；接种 中图分类号：$565．401 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2008)06一oo73—03 甘蓝型油菜(BrassicanapusL．)是我国主要的油料作物， 酸进行催化分解，以及利用H0 诱导的植物防御反应，提高 种植面积和总产量均居世界首位。油菜既是食用油的主要来 油菜抗菌核病的能力。 源，也是提供生物柴油及其他工业原料的经济作物。油菜生 1 材料与方法 育后期易受菌核病危害而导致产量和品质的损失。培育抗菌 核病的油菜品种是解决菌核病危害的重要途径。 1．1 植物材料 从20世纪70年代起 ，研究者们通过抗源筛选 、常规选育 甘蓝型油菜G21—7种子，由江苏省农业科学院经济作 等手段对提高油菜菌核病抗性进行了多方面探索。虽然己从 物研究所提供。甘蓝型油菜 G21—7种子用0．1％的HgC1 油菜中鉴定并筛选出一些抗病种质资源，并利用这些种质资 浸泡 10min，无菌水冲洗 3次，播种于 1／2MS培养基上，每瓶 源培育出一系列抗病品种，但依然不能克服抗源缺乏和选育 播5O粒种子，并在 (26±2)℃和 16h光照／8h黑暗以及 周期长的困难。 1600～2000lx光强下培养，4～5d后取无菌苗的带柄子叶 随着抗病基因挖掘、植物组织培养及植物转化技术的发 (子叶柄长保留1～2mm)。 展，植物基因工程为抗病育种开辟了一条新途径。草酸是真 、 1．2 质粒和菌株 菌分泌的毒素，是核盘菌 (Sclerotiniasclerotiorum)致病过程的 植物表达载体pBIGermin(图1)由中国农业科学研究院 决定因子 J。核盘菌在油菜上可引起严重的菌核病。草酸 生物技术中心提供。菌种为根癌农杆菌LBA4404。 氧化酶(oxalateoxidase，germin)最初是作为小麦的萌芽标记 厂————————————————————] ’ RB—+lnosPwzrnnosT2E35SPQ germinhoST}．-一LB 而被发现，称为胚素 (germin) 。草酸氧化酶可以分解病菌 分泌的草酸，生成CO 和过氧化氢 (H0：)，从而限制病菌的 LB，左边界；RB，右边界；NPTII，卡那霉素抗性基因； nosP，nos启动子；nosT，nos终止子；E，增强子；Q，翻译 生长；草酸被降解后生成的HO 是植物和病原微生物互作 增强序列；germin，草酸氧化酶基因；35SP，35S启动子 中快速合成的一种早期活性氧类，它在植物受病原微生物侵 图1 pBIGerminT-DNA区结构简图 染后可引发一系列反应，如直接杀死病原菌，作为超敏反应组 织者诱导细胞壁结构蛋白