改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析.pdfVIP

维普资讯 药 物 生 物 技 术 PharmaceuticalBiotechnology 2007，14(1)：5～9 5 改造的sTRAIL基因在重组毕赤氏酵母菌中的表达及活性分析 朱明月 ，沈文涛 ，周 鹏 (1．中国热带农业科学院热带生物技术研究所 ／热带作物生物技术国家重点实验室，海南 海 口571101； 2．海南医学院分子生物学重点实验室，海南 海口571101) 摘 要 利用甲醇毕赤氏酵母系统对改造的TRAIL基因进行优化表达研究及产物活性分析，确定改造后 的基因表达量是否提高。应用电转化技术将 4种重组表达载体转化毕赤氏酵母菌GS115，经Zeocin抗生素筛 选、PCR检测获得阳性酵母工程菌，采用摇瓶发酵及 SD PAGE进行高效表达菌株的筛选，经 CM一柱层析 、 Westernblot及 MTT法对重组蛋白进行初步纯化、抗原活性检测和生物学活性分析，确定 了最佳摇瓶发酵条 件：培养基最适pH值 5．5～6．5，最佳甲醇诱导浓度为 1 ，最适 甲醇诱导周期为96h。筛选到高效表达菌株 pPICZmA—sTRAIL／GS115、pPICZmA—sTRAIIK／GS115、pPICZaA—sTRAIIA／GS115、pPICZmA—sTRAIIAK／ GS115，其表达量分别达到 67，113．4，98，145mg／L，改造后的TRAII具有抗原活性和生物学活性。对TRAII 基因的改造可以提高其在甲醇毕赤氏酵母系统中的表达。 关键词 毕赤氏酵母 ；肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 ；高效表达；活性分析 中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1005—8915(2007)01—0005—05 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TNF—re— 我们利用已改造的三种 s订 儿基因构建的分泌型 latedapoptosis—inducingligand，TRAIL)，也称凋 表达载体 pnCT~一A-sTRAII 、pPIC 一A-sTRAILA、 亡素2配体 (Apo2ligand，Apo2I)[1]，是由wi— pPICZ~一A_sTRAIL 转化毕赤氏酵母菌株GSll5，对 ley[2于 1995年利用 已表达序列标签技术 (Ex— 改造的sTRAIL基因进行了分泌表达，对培养基、 pressedsequencetag，EST)首次从人外周血淋 巴 pH、表达时间等发酵条件进行了优化，在优化表达 细胞和人心脏的cDNA文库中克隆并鉴定的一个 的基础上筛选高效表达菌株，并对重组蛋白进行了 调节细胞凋亡过程的TNF家族新成员，广泛表达 初步纯化、抗原活性和生物学活性分析，与未改造 于脾、胸腺、前列腺、肺、小肠、外周血淋 巴细胞等多 的sTRAIL基因表达研究作比较，以确定基因改 种正常组织 中，尤其是在活化 的 CI)3细胞及 造对提高表达量的影响，为提高其他与 sTRAIL CD4 、CD8、TCR细胞表面，均可检测到 TRAIL 基因具有类似结构的基因在毕赤酵母 中的表达量 的高水平表达_3]。它是继 TNF、FasI之后发现的 奠定基础。 第三个TNF家族的凋亡分子，可激活肿瘤细胞的 1 材料与方法 快速凋亡而对正常细胞没有细胞毒性反应，选择性 细胞毒性这一特征使其在肿瘤治疗中有着潜在的 1．1 菌株和质粒 广泛应用前景而倍受人们关注[4]。 pPI 旷A质粒、毕赤氏酵母菌株GS115购于In一 毕赤酵母表达系统具有能够分泌表达 目的 ~trogen公司，分别含有 pPICZmA-TRAII、pPICZa-A- 蛋 白质且能进行翻译后加工等特点而成为首选 1、