嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA文库的构建和亲环蛋白基因序列的初步分析.pdfVIP

第35卷 第5期 水 生 生 物 学 报 Vo1．35．NO．5 2011年 9月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Sep．， 20 11 DOI：10．3724／SP．J．1O35．20l1．00783 嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞 eDNA文库的构建 和亲环蛋白基因序列的初步分析 谢 凯 徐 灵 盛军庆 曾柳根 王军花 洪一江 (南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌 330031) 摘要：实验利用灭活的嗜水气单胞菌 eromonashydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)14h， 将诱导后的池蝶蚌血细胞的总 RNA进行逆转录，用 LDPCR法合成双链 cDNA，从而首次成功构建池蝶蚌 血细胞的全长 cDNA文库。原始文库的滴度为4×10cfu／cm ，重组率为 90％，扩增后文库的滴度为 3．55x10 pfu／mL。目前文库已随机测序 672个样品，将所得双向序列进行拼接，去除载体，并多序列比对去除重复序 列后，发现 436条为已知功能序列，其余为未知功能序列。序列中最小长度 270bp，最大长度为 2153bp，平 均大小608．6bp，表明插入片段大小理想。从文库 中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋 白A(HsCypA1全长 基因并进行序列分析。结果显示，HsCypA全长 1229bp，序列包括 52bp的5非编码区、495bp的开放阅读 框 、682bp的3非编码区和29bp的poly(A)尾，没有明显的加尾信号。对 CypA氨基酸序列二级结构进行 了较详细的分析并进行了三维建模，同时构建了其系统进化树，分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非 常保守的蛋 白家族。综合分析，CypA在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白，而是可能在病原感染防御 中发挥重要作用。 关键词：池蝶蚌；血细胞；cDNA文库；嗜水气单胞菌；亲环蛋 白 中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1000—3207(2011)o5—0783．07 有关低等动物全长 cDNA文库的建立 已有较多 本文利用灭活的嗜水气单胞菌 eromonashy— 报道，如：锯缘青蟹 ](Scyllaserrta)、皱纹盘鲍[，】 drophila)诱导处于旺盛生长期的四龄池蝶蚌，提取 (Haliotdiscushannai)、中国对虾 4【3(Fenneropenaeus 诱导后的血细胞的总RNA，首次构建淡水育珠蚌池 chinensis)及九孔鲍I5~(Haliotisdiversicolorsupertexta1 蝶蚌血细胞 cDNA文库，通过随机测序获得免疫相 等的不同组织 cDNA文库，但在淡水育珠蚌中尚未 关基因并进行序列分析，为后续功能研究提供 了较 见报道。池蝶蚌(Hyriopsisschlegeli)原产于 日本滋 为全面的参考。 贺县的琵琶湖，属软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、帆 l 材料与方法 蚌属，与我 国三角帆蚌为同属不同种，1997年由江 西抚州市洪门水库开发公司从 日本引进，l998年人 1．1 材料 工繁殖成功。池蝶蚌的育珠能力优于其他淡水育珠 诱导用嗜水气单胞菌为本实验室永久保存种， 蚌，对该 品种的育珠性能、人工繁殖 、同工酶比较 、 池蝶蚌采 自江西抚州市洪门水库开发公司国家级池 杂交后代性状 、育珠和胚胎发育、血细胞分型、免 蝶蚌良种场，四龄，健康。置于实验室水族箱中暂养， 疫方面等相关基因等方面的研究已全面开展并 已有 水温为 18—25℃，每天上午和下午换曝气的水各一 一 些报道 [6--12】 次。CreatorMSMARTTM cDNALibraryConstruction 收稿 日期：