双重调控选择增殖型腺病毒CNHK500的构建及初步研究.pdfVIP

维普资讯 · 1366 · ：2004年 11月第21卷第儿规 ChinJExpSurg,November2004,Vol21,No．11 · 实 验 研 究 · 双重调控选择增殖型腺病毒 CNHK500的 构建及初步研究 张琪 彭林辉 吴红平 崔贞福 钱炎珍 姜梨华 苏长青 吴孟超 钱其军 【摘要】 目的 研制出一种双重调控的选择增殖型腺病毒载体系统。方法 先后经 2次定点 突变重叠聚合酶链反应 (PCR)技术使腺病毒 EIA及E1B启动子缺失，并将人工合成的人端粒酶逆 转录酶启动子和缺氧反应启动子分别插入EIA及E1B基因的上游，得到腺病毒载体质粒 pSGS00。 通过 DSG500与质粒pBHGE3在 293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500。扩增、纯化病毒， 用TCID50方法测病毒滴度。通过病毒增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。结果 成功构 建了由双重调控选择增殖型腺病毒 CNHK500，病毒滴度为 1．9x10加pfu／ml，增殖实验结果证实 CNHK500可 以选择性地在端粒酶阳性肿瘤中增殖。结论 CNHK500为肿瘤的生物治疗提供 了 一 种新的策略。 关【键词】 腺病毒 ； 端粒酶 ；缺氧反应元件； 缺氧诱导因子一1 ConstructionofCNHK500．aconditionallyreplicatingadenovirusdriven bythehuman telomerasere- versetranscriptasepromoternadhypoxiaresponsepromoter zHANG Qi．PENG Lin—hui。WU Hong~ping，eta1．Viraland Gene Therapy Center，Eastren Hepatobiliary Surgrey Hospital，Second M ilitaryMedicalUniversity，Shanghai200438，China A【bstract】 0bjective Todevelopandouble—regulatedreplicativeadenovirus．Methods Thean— dogenousE1A na dE1Bpromoterswerede1etedbydoublepointmutationPCR ．Humantelomerasereverse transcriptasepromoterandhypoxiaresponsepromoterweresynthesizedandclonedintotheupstream of E1A geneandE1BgenerespectivelytoproduceplasmidpSGS00．TheplasmidpSGS00wasco-transfected withpBHGE3 in293cellstOgeneraterecombinna tadenovirusCNHK500．Therecombinantadenoviruses wereverifiedbyPCR，purifiedbycesium chloridedensitypurificationandpropagatedin293ceUs．Virus titerWas meastlredbyTCID50method．VirusreplicationassayWas performde tOevaluatetheselective replicationabilityofCNHK500．Results A new conditionallyreplicatingadenoviursCNHK500Was con— structde anditStiterWas 1．9×10 pfu／m1．ProliferativetestrevealedthatCNHK500couldselectivelybe proliferatedintumorspositivefortelomerase．Co nclusion CNHK500mayprovideanew strategyfortU— morbiotherapy． K【eywords】 Adenovirus； Telomer~se； Hypoxiaresponseelement； Hypoxiainduciblefactor-1 综合治疗作为肿