Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中的应用研究.pdfVIP

亏 与壁 物 互猩 2011，Vo1．28No．8 Chemistry Bioengineering doi：10．3969／j．issn．1672—5425．2011．08．O17 Red重组系统在克雷伯 氏肺炎杆菌中的应用研究 莫隽颖 ，陶 冶。周佳佳 ，高黎荣 ，付水林 ，宫 衡 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237) 摘 要 ：通过改造pKD46与 pCP20质粒为含 四环素抗性标记 的pKD46一Tc与 pCP20一Tc重组质粒 ，初步建立 了一套 能在 K．pneumoniae菌株 中运用的 Red重组系统 。以荚膜基 因中的高保守基 因wzi为敲除对象 ，导入 同源臂为 250bp 的打靶 片 Awzi：：FK，转化后得 到 6个重组子 ，初 步确 定敲 除了 K．pneumoniae菌株 的荚膜基 因wzi。 关键词 ：克雷伯 氏肺炎杆菌；荚膜 多糖基 因；Red重组 ；基 因敲除 中图分类号 ：Q819 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2011)08—0063—04 目前，克雷伯 氏肺炎杆菌基因敲除的相关研究多 E．coliDHSu、pKD46、pKD4、pCP20，自行保 为利用 oriR6K型 自杀质粒的传统敲除方法口 ]，其实 存 ；载体 pMD18T、质粒 pBR322，TaKaRa公司。 验周期较长 ，且整合到受体菌株基因组上 的抗性标记 1．2 限制性 内切酶与主要试剂 无法去除 ，不适用于多基因突变的研究。 XmnI限制性 内切 酶，Fermentas公司 ；T 连接 Datsenko等_5构建 了一套适用于 E．coliK一12菌 酶 、DL10000TMDNAMarker，TaKaRa公司；2×Taq 株靶基因快速敲 除的Red重组质粒系统 。该系统需 PCR M asterMix、2×TaqPlusPCR M asterM ix、DNA 要 3类质粒，分别是 ：表达Exo、Beta、Gam蛋白的协助 MarkerllI、细菌基因组 DNA抽提试剂盒、质粒小量提 同源重组质粒 pKD46、pKD20等；两侧含 FRT位点的 取试剂盒 、琼脂糖凝胶 回收试剂盒 ，北京天根公司；其 抗性基 因的质粒 pKD3、pKD4、pKD13；受诱导表达 它试剂均为国产分析纯 。 FLP重组酶 以消除基 因组上 同源重组抗性基 因的质 1．3 细菌培养、电转化及 PCR方法 粒 pCP20。利用 Red重组质粒系统敲除靶基 因的主 参见 《分子克隆》。 要流程是 ：(1)以pKD3／pKD4为模板，设计含 40～6o 1．4 引物设计 bp靶基因的同源序列引物 ，PCR扩增含 FRT位点的 实验所用引物 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合 抗性基因(打靶片段)；(2)将打靶片段转化到 已表达 成 ，见表 1。 Red重组酶 的宿主 中，抗性筛选 阳性克隆；(3)将 1．5 适用于克雷伯氏肺炎杆菌的 Red重组系统的构 pCP20导入筛选 出的重组子 中，诱导 FIP重组酶表 建 达，移除抗性标记。Red重组质粒系统已被证 实也能 由于K．pneumoniae菌株本身含有 Amp抗性，故 在其它一些菌株 中有效地敲除靶基 因[6’，但 目前 尚 pKD46与 pCP20质粒不能直接用于该菌株 的基因敲 没有 Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌 中应用 的报 除实验，需要对其改造。通过序列查找发现这两个质 道。作者在此 以荚膜基 因wzi作为敲除对象l8]，研 粒的Amp抗性基 因上有一个 XmnI限制性酶切位 究了Red重组系统在克雷伯 氏肺炎杆菌中的敲除效 点，且整个质粒 中该位点只有一个_l，在该