国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法-基孔肯雅病毒 编制说明.docVIP

行标编制说明 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 国境口岸oop-mediated Isothermal Amplification(LAMP) for Chikungunya virus 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同 修改 非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 关于下达2013年第一批出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知（国认科[201]35号基孔肯雅热1952年首次发现在坦桑尼亚流行，并从严重关节炎患者血液中分离出基孔肯雅病毒。基孔肯雅热的分布与媒介伊蚊的分布相关。基孔肯雅热主要在非洲呈地方性分布东南亚地区、印度、斯里兰卡及西太平洋地区的热带或亚热带国家呈地方性流行。我国曾于80年代报道在云南发现存在基孔肯雅病毒人群普遍易感，具有引起本病流行的条件因此在出入境口岸加强本病监测和控制防止本病传入我国并引起流行，是当前口岸卫生检疫工作一项重要的任务。2008年3月广东检验检疫局RT-PCR方法从赴斯里兰卡务工回国人员检出2例基孔肯雅，是我国内地首次发现的输入性基孔肯雅热病例基孔肯雅热病例RT-PCR方法虽然准确可靠，但需要合成荧光标记探针，且需要荧光定量PCR仪，检测成本非常昂贵，不适合应用于疫情暴发时对大量样本的检测，也无法在基层检验检疫系统及疾病预防控制系统普及。因此，研究一种简单、快速，便宜且不需要大型仪器设备，适合于基层卫生系统使用的基孔肯雅基孔肯雅(LAMP)技术是2000年由Notomi等首先报道的一种新型敏感的链取代核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。该方法能在恒温条件下(约65 ℃) 、一个小时内，将目的DNA 从几个拷贝扩增到109 个拷贝。由于该等温基因扩增方法没有升降温过程，反应条件易于控制，设备简单（该方法不需任何大型仪器设备，只需一台水浴锅即可在一个小时内快速检测出登革病毒核酸），而且在灵敏度和特异性方面丝毫不逊色于传统的PCR，因而成为未来核酸检测的主要发展方向，与PCR及血清学方法比较具有明显的优势，特别适合应用于国境口岸。 本标准拟应用LAMP技术，研制基孔肯雅.1 核酸提取试剂：使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，详见说明书。 3.2 Bst DNA聚合酶购自广州天骐生物科技有限公司。 3.3 灭菌双蒸水。 3.4 LAMP检测的引物组合序列 F3 5’- CGCCCTCTTTAACGGACATG -3’ B3 5’- AATTCGGCGCTGGCTAAG -3’ FIP 5’ - TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATA-TACCAGCCTGCACCCATT -3’ BIP 5’ - AGTGTGCGGTGCATTCGATGA-TGCAGCTGAGAATTCCCTTC -3’ F2 5’ - TACCAGCCTGCACCCATT -3’ F1c 5’ - TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATA -3’ B2 5’ - TGCAGCTGAGAATTCCCTTC -3’ B1c 5’ - AGTGTGCGGTGCATTCGATGA -3’ 4、样品采集、处理、核酸提取 4.1 人血液样本：静脉采集疑似病人抗凝全血5mL，4℃以下保存运输（参见SN/T 3560-2013）。 4.2 蚊虫样本：采集活蚊后迅速低温冷冻（参见SN/T 2300-2009）。 4.3 核酸提取：按照Qiagen公司RNA提取试剂盒进行。 5、cDNA制备 cDNA制备利用宝生物公司的PrimeScriptTM RT reagent kit逆转录试剂盒进行。 40μl cDNA合 成反应体系如下：5×buffer，8μl；Enzyme Mix，2μl；Oligo dT primer，2μl；Random 6mers，8μl；RNA， 20μl。 6、LAMP反应体系 构建25μl 的LAMP反应体系：反应液RM，12.5μl；引物混合物PM，1μl（其中FIP反应终浓度 1.6μM，BIP 1.6μM，F3 0.2μM，B3 0.2μM）；Bst DNA聚合酶，1μl；cDNA，2μl；ddH2O，8.5μl。 7、One-step RT-LAMP反应体系（25μl）： 反应液RM，12.5μl；引物混合物PM，1μl（其中FIP反应终浓度1.6μM，BIP 1.6μM，F3 0.2μM， B3 0.2μM）；Bs