酶联免疫吸附测定试验（ELISA）的操作要点.pdfVIP

2008年3月 《中外健康文摘》临床医药版 第5卷第3期 文章编号：1672-5085（2008）03-0008-03 中图分类号:R446.6文献标识码： B 【论 著】 酶联免疫吸附测定试验 （ELISA）的操作要点 吴 娟 （北京大学人民医院 北京肝炎试剂研制中心 100044） 【摘要】目的 探讨酶联免疫吸附测定试验的操作要点。临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条 为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、 结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚， 现将操作中的体会分述如下。 【关键词】ELISA;测定试验;操作要点 1 标本的收集和保存 法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清 （浆），有 一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试 时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便 剂的准备最为关键的是： 等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染 （1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温 性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细 下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与 胞因子和治疗药物等。 室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步 用于传染性病原体的抗原和抗体的血清标本的收集则没 骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度， 有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以 以满足测定要求。 下几个方面： （2）目前的ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用 （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素 时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或 基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶 去离子水应保证质量。 的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就 （3）当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显 很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底 色前临时配制。 物反应显色，从而产生非特异性发应。 3 加血清样本及反应试剂 （2 ）样本的采集及血清分离中要注意尽是避免细菌污 在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合 染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体 物、加底物。 等蛋白产生分解作用；二则对用相应酶作标记的测定方法产 在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是 生非特异性干扰。 唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器 （3）血清标本宜在新鲜时检测，放置时间过长均可产生 加样必须注意的关键点是： 假阳性反应，如在冰箱中保存过久，可发生聚合，在间接法 （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和 中可使本底加深。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在 产生气泡； 2-8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染，有些 长时间保存，应在-70℃以下。 测定需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反 加样,也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然 复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的