比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究.pdfVIP

维普资讯 · 2198 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 12012：!塑二 ! [文章编号] 1000—4718(2004)12—2198—04 比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为 心肌细胞的实验研究 钱海燕， 李庚山，徐红新， 吕菁君， 蒋 雯， 王 晶 (武汉大学人民医院心内科 ，湖北 武汉 430071) [摘 要] 目的：比较体外不同分化条件下胚胎干细胞(ESC)分化为心肌细胞的分化 比率。方法 ：用布法罗大 鼠肝细胞 (BRL)条件培养基抑制 ESC分化及保持其增殖，以维甲酸(RA)、二甲基亚砜 (DMSO)、转化生长因子 (TGF 一 81)及激活素一A(aetivin—A)为分化诱导剂，组合成6种分化培养基，采用悬滴悬浮、贴壁三步法诱导ESE分化为心 肌细胞，比较各组分化比率。结果：6种分化条件均能使 ESE分化为心肌细胞，其中以TGF—B1(2 L)、activin—A (20t,g／L)及20％胎牛血清 (FCS)组成的分化培养基可以使高达92．80％4-2．22％的ESC分化为心肌细胞，分化 比率 显著高于其它各组 (P0．01)。结论：以BRL条件培养基培养 ，TGF一13l、aetivin—A作分化诱导剂可作为一种理想的 ESC体外分化体系。 ’ [关键词] 胚胎干细胞；心肌 ；细胞；分化 [中图分类号] R363 [文献标识码] A 小 鼠胚胎干细胞 (embryonicstemceils，ESC)是 由 一 抗 a一肌动蛋 白(a．sarcmericactin)、心肌肌钙蛋 白 小鼠早期胚胎的内细胞团或桑椹胚分离而建立 的具 一 T(cardiactroponin—T，cTn—T)均购 自Sigma；胰蛋 有分化全能的细胞系…1。ESC的显著特征是可以保 白酶、EDTA购 自Amresco；SP试剂盒及 DAB显色试 持在体外不分化状态下的无限增殖能力，并仍具备 剂盒购 自中山生物工程有限公司。 稳定的发育潜能 J。在体外特定条件下，ESC可 以 2 方法 分化为三个胚层几乎所有类型细胞 J。由于 ESC的 2．1 BRL条件培养基制备 BRL细胞复苏后接种 分化全能性，有学者研究建立特定的分化诱导条件， 于 10％FCS的高糖 DMEM培养基 中，调密度至 2x 使ESC向心肌细胞分化，从而建立心脏发育模型或 108ceHs／L， 以5×1o4至 8×104cells／cm2接种到培养 移植至宿主心脏 以代替缺失心肌细胞，修复心脏结 瓶 中，置 37oC、5％co2饱和湿度培养箱中培养，2—3 构与功能 J。但迄今 ESC向心肌细胞分化 比率并不 d传代 1次，每 3d收集 1次培养基，可收集 1—3周。 高，本实验拟在前人研究基础上，比较不同分化条件 将收集的培养基离心除去细胞 ，得到的BRL培养液 下 ESC的分化 比率，以建立一个稳定、高效、简便的 与ESC培养液以60／40(v／v)比例混合，补足 FCS至 分化方法 。 15％，B—Me至0．1mmoL／L，L—Glu至0．1mmoL／L，即 材 料 和 方 法 成 BRL条件培养基。 2．2 ES—D 细胞培养 0．1％明胶预先包被培养 l 材料 瓶，ES—D 细胞复苏后以2×107至 5×107ceHs／L种 1．1 胚胎千细胞 一D 细胞株 (embryonicstemcells， 植于培养瓶中，添加 BRL条件培养基，置 37oC、5％ ES—D) 购 自中国科学院上海细胞所。