快速液相色谱法测定乌头类药材中三种生物碱成分的含量.pdfVIP

快速液相色谱法测定乌头类药材中三种生物碱成分的含量 1 范围 本方法采用快速液相色谱法测定乌头类药材中的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱。 本方法适用于乌头类药材中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量测定。 2 实验材料和仪器 2.1 试剂（除特殊注明外均为分析纯试剂） 甲醇（色谱醇）、乙醚、氨水、乙酸铵。 2.2 仪器设备 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统(RRLC)，配有二元泵、自动进样器、二极管 阵列检测器(DAD) 。 3 分析条件 3.1 三种生物碱对照品溶液的制备和质控样品（QC ）的制备 分别精密称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品各约10 mg，置于同一10 mL 量瓶中， 网 加0.05%盐酸甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得1 mg/mL 的混合对照品储备液。储备液经0.05% 盐酸甲醇适当稀释得8 个系列浓度的工作溶液。质控样品也按上述操作制成低、中、高三种浓 度的混标。 3.2 色谱分析条件 析 色谱柱：Zorbax Extend C18，(4.6 × 50 mm，1.8 μm ，Agilent) ；柱温：30 ℃；检测波长： 235 nm ；流速：2 mL/min ；进样量4 μL ；流动相：A ：0.26 ％醋酸氨 (加2.5 mL冰醋酸于1000 mL 水中，用氨水调pH值至9.8)，B ：甲醇；梯度洗脱，如下。 分 时间 (min) B 相% （V ） 0 30 2.5 50 5 急60 6 65 8 70 10 70 3.3 乌头类药材供试品溶液的制备 应 乌头类药材，研磨成粉末，过40 目筛，称取药材粉末约0.5 g，置于50 mL 三角瓶中， 加入1 mL 氨水浸润30 min，加无水乙醚10 mL，称重，超声30 min，冷却至室温，补足减失 的重量，将提取液转移至鸡心瓶中，残渣用无水乙醚洗涤3 次，每次5 mL，30 ℃水浴旋转蒸 国 发至干，然后用适当体积的0.05%盐酸甲醇溶解残渣，0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液作为供试 品溶液。 4 方法确认 4.1 色谱图 中 根据建立的RRLC 条件分析，得到三种生物碱对照品和样品供试液的色谱图。 4.2 最低检测限(LLOD)和最低定量限(LLOQ)的测定 将工作溶液逐级稀释，进行RRLC 分析，记录样品每次测定得到的信号强度与噪音的比 值，信噪比S/N≥3 时的量即为最低检测限(LLOD)，S/N≥10 时的量即为最低定量限(LLOQ) 。 4.3 标准曲线和线性范围 将系列浓度的混合对照品溶液，按已建立的色谱条件进行测定。分别以新乌头碱、乌头 碱、次乌头碱峰面积的积分值为纵坐标(y)，对应的对照品溶液的浓度为横坐标(x)，绘制标准 曲线，计算新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的线性回归方程及相关系数(r)值。 4.4 精密度 用测定日内及日间质控样品浓度变化来验证方法的精密度及准确度，测定低、中、高三 种不同浓度的质控样品，将峰面积带入相应的标准曲线计算浓度，日内精密度实验对同一浓 度的对照品溶液连续测定6次，计算浓度的RSD(%) 。日间精密度实验中对不同浓度的质控样 品溶液连续测定4天，计算浓度的RSD(%) 。 4.5重复性 称取同一份乌头类药材粉末6 份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依上述RRLC 条件分别进行测定，计算乌头类药材中三种生物碱平均含量的RSD(%) 。 4.6 稳定