HIV-1P24蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备.pdfVIP

696 重庆医学2012年 3月第 41卷第7期 · 经验交流 · HIV一1P24蛋 白的原核表达及单克隆抗体的制备 汪龚泽 ，刘朝奇，杨建林，覃晓琳 ，吕佰瑞，姚佳红 (三峡大学分子生物学研究所 ，湖北宜昌443002) 摘 要：目的 制备 HIV-1P24蛋 白及单克隆抗体 ，建立酶联免疫吸附测定(ELIsA)法检测 HIV感染。方法 聚合酶链反 应(PCR)扩增p24基因，并将其克隆到原核表达载体 pET-28a(十)中，经E．coli表达并纯化HIV-1P24蛋白。以纯化P24蛋白抗 原免疫Balb／c小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤 SP2／0细胞融合，制备能产生P24单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用Western blot、ELISA技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定，建立检测P24蛋 白含量的ELISA竞争法。结果 原核表达重组质粒在 E． coli中能高效表达 P24蛋 白，从杂交瘤细胞中选取能稳定分泌P24单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用ELISA竞争法检测 HIV-1阳 性的血清中P24蛋 白含量与病毒载量显著相关。结论 P24蛋 白及特异性单克隆抗体成功制备，并建立了检测P24蛋 白含量的 EL1SA 竞争法。 关键词：免疫缺陷病毒；质粒；抗体，单克隆；酶联免疫吸附测定 doi：10．3969／i．issn．1671—8348．2012．07．026 文献标识码 ：B 文章编号 ：1671—8348(2012)07—0696-03 人类免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirus，HIV) 究所保存 。 是艾滋病的病原体，主要通过性接触、血液和母婴传播。近年 1．2 pET28a(+)-p24基 因重组质粒 的构建 以HIv_1hbx2 来，HIV感染呈上升趋势。中国自1985年发现第一例艾滋病 基 因为模板 ，聚合酶链反应 (polymerasechainreaction，PCR) 患者 以来 ，截至 2009年 1O月底 ，累计报告艾滋病病毒感染者 方法扩增 p24基 因。设计 引物为：5r-CAG GATCCCTAT 和患者 319877例 ，2009年当年新发 HIV感染者 4．8万人 ，中 AGT GCA GAA CAT CCA GG-3；51_CGA CTC GAG CAA 国艾滋病疫情形势严峻_1]。而 目前检测血清 HIV抗体是诊断 AACTCTTGCCTTATGG-3，其引物 中分别引入酶切位点 HIV感染的常规方法，但该检测具有较大的局限性，这是因 BarnHI／x^oI。原核表达载体 pET28a(+)用 BarnHI／XhoI双 为：超过7O 的HIV感染者在感染 6个月后才能检测出抗体， 酶切将其线性化后，与p24目的基因的酶切产物于 16℃连接 在同性恋群体 中，这个数字超过 8O ，检测抗体方法增加 了 过夜。5 “L连接产物转入 E．coliDH5a中，接种 LB卡那霉素 HIV “窗口期”传播的危险[2；另外，新生儿产生 HIV抗体一 抗性固体培养基 ，37℃培养过夜，挑取单克隆至 1．5mL卡那 般在 出生 1年后 ，来 自母体 的HIV抗体造成新生儿假 阳性 ；由 霉素 LB培养基 中，37℃培养过夜，次 日提取质粒用于酶切和 于HIV抗体在疾病过程中持续存在，到艾滋病晚期才消失，它 测序鉴定 。 无法作为治疗监测的稳定指标 J。 1．3 pET28a(+)一p24基 因原核表达与鉴定 将构建好 的重 P24是 HIV病毒颗粒的主要结构蛋 白，是结构基 因gag 组质粒 pET28a(+)一p24转化到宿主菌BL21(DE3)中，经异丙 的产物，在病毒的包装和成熟过程中发挥重要作用_4]。P24蛋 基一I)_硫代半乳糖 苷 (isopropyl—beta—D-thiogalactopyranoside， 白的氨基酸序列在 HIV各毒株之间高度保守，缺失P24的病 IPTG)(终浓度