固氮斯氏假单胞菌固氮调节基因ntrB的功能研究.pdfVIP

高淼等：固氮斯氏假单胞菌固氮调节基因ntrB的功能研究 固氮斯氏假单胞菌固氮调节基因ntrB的功能研究① 高 淼②’ 陈 明③” 何升。 窦岳坦。 侯胜强’ 平淑珍。 张维’ 陆伟。 王玉炯③“ 林敏+ (’中国农业科学院生物技术所 北京100081) (“宁夏大学生命科学学院西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室银川750021) 摘要利用三亲接合的方法将含有ntrB基因部分序列的自杀载体导入固氮斯氏假单 胞菌(Pseudomonas 实验证明，AdnB菌株中与ntrB连锁的下游基因mrC能正常转录；ntrB基因的非极性突变 导致细胞完全丧失固氮能力，但其突变株能在含NH4+的基本培养基K中正常生长；在以 硝酸盐为唯一氮源时，AdnB比野生型A1501的细胞生长延迟约14～18h，认为ntrB基因 与硝酸盐的氮代谢有关。功能互补实验结果表明，AdnB的功能互补菌株能完全恢复细胞 的固氮作用和对硝酸盐的利用。 关键词斯氏假单胞菌A1501，ntrB非极性突变株，功能互补 的变化，进而影响整个氮代谢系统的表达的【6l。然 0引言 而，在棕色固氮菌(Azotobaaer 固氮斯氏假单胞菌A1501是分离于水稻根际的不参与固氮酶系统的表达调控，可能存在一条非 一种联合固氮菌…，它具有固氮、促生和耐盐等优良 rurC磷酸化的铵调控途径[4f。 特性幢J，但其固氮活性受到铵、氧等环境因子的影 斯氏假单胞菌A1501基因组序列分析表明，斯 响。周氮过程中的信号传导机制以及固氮相关基因 表达凋控的分子机制的探索和研究，长期以来受到 谢中的作用目前尚无报道。本研究通过构建斯氏假 科学界的广泛关注。目前的研究表明，微生物具有 复杂而精密的信号系统，该系统具有感受、传导和应 功能互补菌株试验，分析了ntrB基因对斯氏假单胞 答外界环境变化的能力，蛋白磷酸化是微生物进行 菌A1501细胞生长和固氮活性的影响，为揭示斯氏 信号传导的一种重要方式。现已发现，在固氮模式 假单胞菌固氮级联调控机制奠定了基础。 菌株肺炎克氏杆菌中，mrBC基因编码的蛋白就是 通过蛋白磷酸化进行信号传导的，其传导系统是由 1 材料与方法 感应器和反应调节蛋白组成的一种双组分调控系 统【34J。NtrB是一种由38kD亚单位组成的二聚体1．1菌株和质粒 “传感”蛋白，具有十分保守的C．末端。NtrC是“调 本研究实验所用的质粒和菌株见表1。 节”蛋白，是由52kD亚单位组成的二聚体，其N．末1．2培养基及生长条件‘7 端区域十分保守【5J5。NtrB感受外界环境变化，使 斯氏假单胞菌在无氮培养基K【7]或者在含 NtrC磷酸化或去磷酸化，进而引起氮代谢中几个重 10mM NOr或N町的无氮培养基K中30℃培养，大 要基因和操纵子的活化或抑制。虽然NtrB不直接肠杆菌LB培养基中37℃培养。 参与调控基因的转录，但它对整个氮代谢以及生物 1．3试剂 固氮起到至关重要的作用【3]3。巴西固氮螺菌等固氮 生化与分子生物学试剂购自平皓试剂公司和上 菌种均是通过双组分调控系统N曲c感应环境中铵 海生工生物公司；限制性内切酶、T4连接酶、RNA提 ①863计划(2001AA214021)和973计划(2001Cm08904)资助项目。 ②女，1978年生．硕士生；研究方向：微生物基因工程。 ．00m，wyj@咖．如．en ③鹾．系厶姥E-mail：ehenmin#,io@ (收稿日期：2∞7-02—14)