实验13地衣酚法测定RNA含量.docVIP

实验13 地衣酚法测定RNA含量 一、目的 学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术。 二、原理 核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。 地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的RNA含量。 三、材料、试剂和器具 （一）试剂 1、RNA标准溶液：取酵母RNA配成200微克/毫升的标准溶液（如不溶，可滴加氢氧化铵溶液，调至pH=7.0） 2、样品溶液：RNA浓度在20~100微克/毫升范围内。（自己提取） 3、地衣酚试剂，先配制0.1%三氯化铁浓盐酸溶液（A、R）。使用前再用上述溶液为溶剂配成0.1%的地衣酚溶液。（临用时配制） （二）器具 1、试管及管架 2、水浴锅 3、移液管（1，2，5ml） 4、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）RNA标准曲线的制作 取8支试管，编号，按下表加入试剂 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 RNA标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1..8 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 地衣酚试剂 2 2 2 2 2 2 2 2 加毕，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷却，测0.D670nm值。以0.D670nm值为纵坐标，RNA含量（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。 （二）样品的测定 取0.2~0.5毫升样品液于试管中，加蒸馏水稀释至2毫升，后加2毫升地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮15分钟，冷却，测0.D670nm。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度的RNA的含量，按下式计算样品中RNA的百分含量。 RNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数 RNA产率（%）= 含量/毫升×总体积 ×100 新鲜肝重（g）×106 五、注意事项 样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。 六、实验报告 附上绘制标准曲线图，并计算RNA的含量及产率。 七、思考题 1、采用该法测定RNA的含量有何优点及缺点？ 2、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响？