C-端截短变异的HBx真核表达质粒的构建及表达.pdfVIP

· l090· 旦 堂塑 堂苤查 至 箜 鲞箜 塑 ChinJGastroenterolHepatol，Dec2010，Vo1．19，No．12 基础研究 C-端截短变异的HBx真核表达质粒的构建及表达 张 释 ，潘庆春 ，臧 国庆 上海交通大 学附属上海市第六人 民医院感染病科 ，上海 200233 【摘要】 目的 构建羧基端缺失 3O个氨基酸的HBx蛋 白的真核表达质粒，并在真核细胞 内稳定表达。方法 提取 HBV—DNA阳性 血清总DNA，PCR扩增截短变异的HBx基 因(HBx)，克 隆到真核质粒 pEGFP—N3中，酶切及测序鉴定 。利用脂质体将重组质粒转染 HepG2细胞 ，通过 Westernblot方法检测细胞内截短变异的HBx蛋白的表达。结果 构建的重组质粒 pEGFPN3／x经酶切及测序鉴定 结果正确。质粒 pEGFP—N3／x转染细胞后可检测到 目的蛋白。结论 成功构建在真核细胞内稳定表达的重组质粒pEGFPN3／x。 【关键词】 基因变异；HBVx基因；乙肝病毒；真核表达质粒 中图分类号 ：R735 文献标识码 ：A 文章编号 ：1006—5709(2010)12—1090—02 收稿 日期 ：201005．24 Construction and expression ofeukaryoticexpression plasmid carryingmutantofhepatitisB vi- rusX with C-terminaldeletions ZHANGWei，PANQingchun，ZANGGuoqing DepartmentofInfectiousDiseases，Sixth People’S HospitalAffiliated to ShanghaiJiao Tong University，Shanghai 200233，China 【Abstract】 0bjective ToconstructeukaryoticexpressionplasmidcarryingmutantsofhepatitisBvirusXgenewith C—terminaldeletionsof30aminoacids．andtodetectitsexpression inHepG2cells．M ethods TheHBV xgenewith C—terminaldeletionswasamplifiedbyPCR from theserum ofHBV—DNA positive，then subcloned intovectorpEGFP— N3．Therecombinantplasmid wasidentified byenzymedigestion and sequencing analysis，then wastransfected into HepG2 cellsbyliposometransfection．TheexpressionofHBV xproteinwasexaminedbyW estern blot．Results The resultsofagaroseelectrophoresisshoweda390bpendonucleasedigestionproductin sizethatwasthesameastheexpec— ted．andthesequencingwascorrect．HBV xproteinof390bpwasdetectedinHepG2cellswithpEGFP—N3／xtransfeet— ed．Conclusion TheeukaryoticexpressionplasmidpEGFP—N3／xwassuccessfullyconstructed．And thenew plasmid canexpressHBV xwithC—terminaldeletionsineukaryoticcells． 【Keywords】 Mutant；HBVXgene；HepatitisBvirus；Eukaryoticplasmid HBVX蛋 白是一种具有反式作用的调节蛋 白，能 六人民医院感染科住院病人 自愿捐献。 直接或间接激活 c．myc、c．f0s、c．jun和ras等肿瘤基因， 1．1．2 主要试剂 ：PCR试剂盒