连接产物的转化重组质粒鉴定.pptVIP

猪2型圆环病毒ORF2基因的原核表达 猪2型圆环病毒（PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的病原，其不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤（CT）、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）有关，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。 目前，PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一 PCV2全基因为1 767 bp或1 768 bp，共有11个阅读框，其中ORF1和ORF2是其最主要的阅读框。ORF1为945 bp，编码315个氨基酸，编码病毒的复制蛋白，与PCV1的ORF1编码的蛋白有相同的抗原性。ORF2为702 bp，编码234个氨基酸，编码PCV2的结构蛋白-壳蛋白Cap，具有较好的免疫原性。ORF2的氨基末端区域的12～18和34～41位氨基酸对核定位起重要作用，而69～83和117～131位氨基酸所形成的位点对PCV2抗血清有特异性。 本研究利用PCR手段，对ORF2序列(AB246193)进行扩增。由于ORF2序列中包含疏水序列，难于进行原核表达，故将其基因序列除去疏水性碱基后约580bp克隆入pET-32a Vector，在BL21-ΔE3中用IPTG进行诱导表达。然后通过SDS对表达蛋白进行检测。测序及western blot检测表达产物的正确性。PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的顺利表达，为研制PCV2的ELISA检测方法及其抗体制备奠定了基础。 PCV2的DNA提取 按TaKaRa公司DNA提取试剂盒说明进行。 引物设计 GenBank基因库中已登录 用Primer Premier 5.0软件 ORF2引物序列设计如下： P1：5’-TTA GGA TCC CAA TGG CAT CCT CAA CAC-3’ P2：5’-TTA AAG CTT AGG GGT TAA GTG GGG-3’ 为了便于克隆在引物P1中引入了BamHⅠ酶切位点，引物P2中引入了HindⅢ酶切 位点，同时为了方便表达及表达产物的纯化删去了终止密码子，引物由上海博亚生物技 术有限公司合成。稀释为10pmol/μL，－20℃保存备用。 ORF2的PCR扩增： PCR反应体系(50μL)如下： Premix Taq 25μL P1 1μL P2 1μL 模板DNA 1μL ddH2O加至50μL 混匀后放入PCR自动扩增仪中进行扩增，扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变 性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸10 min。 PCR产物回收 (按TaKaRa公司PCR纯化试剂盒说明进行) 目的基因的克隆 扩增片段的克隆参照pMD18-T载体克隆试剂盒使用说明，将扩增片段电泳回收后直接进行连接，随后将连接产物转化DH5α感受态细胞，用Amp+挑选阳性克隆。克隆菌用U-gene质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行电泳、酶切、PCR扩增和测序鉴定。 PCR产物与pMD18-T载体的连接 pMD18-T vector的两个3’末端各有一个突出的胸腺嘧啶（T），而TaqDNA酶具有加尾特性（A），可使PCR产物形成粘端，这样使连接效率大大提高。 连接体系如下： 2×rapid ligase buffer 5μL pMD18-T载体(50 ng/μL) 1μL T4 DNA连接酶(3 U/μL) 1μL ddH2O 3μL 混匀后16℃连接过夜。 感受态细胞的制备 从37℃培养过夜的新鲜培养基中挑取DH5α单菌落，接种于3 mL（不含抗生素）LB的培养液中，振荡培养过夜。 取50μL过夜培养物，按1:100比例接种于50 mL LB培养液中剧烈振荡培养约3h，至OD600为0.6。 无菌条件下，转移细菌培养物至一个无菌且用冰预冷的50 mL离心管中，冰浴10 min冷却。 4℃下4000 r/min离心10min，弃上清，倒置离心管沥干液体，加入25 mL 100mmol/Lol/L冰冷的CaCl2溶液，悬浮菌体沉淀，置冰浴放置45 min。 4℃下4000 r/min离心10min，弃上清，用2 mL 0.1mol/L冰冷的CaCl 2 （可含15%甘油）重悬浮菌体，然后分装于冰冷、无菌的eppendorf管中(100μL/管)，可4℃静置12 h～24 h备用或冻存于－70℃冰箱备长期使用。 连接产物的转化 重组质粒鉴定 在无菌条件下挑取平板上的单菌落，接种于含有 1 mL 液体 LB 培