EPO的杂质检测方法.pptVIP

* 确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD: MVD=cL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值; c为供试品溶液的浓度，如供试为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1,计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L; λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。 * 鲎试剂灵敏度复核试验 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0. 1ml鲎试剂溶液的10* 75mm试管或复溶后的0. 1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml 不同浓度的内毒素标准溶液， 每一个内毒素浓度平行做4管; 另外2管加0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃士1℃的恒温器 中，保温60分钟士2分钟。 * * 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度若管内形成凝胶，且不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 * 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。 λc=lg-1(∑X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个是阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 * 抑制性干扰试验 适用情况： 1.进行新药的内毒素检查试验前 2.无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时 3.当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺 改变或 试验环境中发生了任何有可能影响试验结果 的变化时，须重新进行干扰试验 * 按下表制备溶液A、B、C和D，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。 * 按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。 Et =lg-1(∑Xt/4) Es =lg-1(∑Xs/4) Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值。 当Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。 * 检查法 凝胶限量试验 按下表制备溶液A,B,C和D。使用稀释倍数为最大有效稀释倍数并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 凝胶限量试验溶液的制备 注: A为供试品溶液, B为供试品阳性对照，C为阳性对照，D为阴性对照。 * 结果判断 保温60分钟+2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。 * 六.异常毒性检查法 本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全验检查制品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。 原理：用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其毒性反应。反应的判断以试验动物的死亡与否为终点。 * 检查法 ------ 小鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用5只小鼠，注射前每只小鼠称体重，应为18-22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml,观察7天。观察期内,小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合