国境口岸肠出血性大肠埃希菌O104：H4检验方法 意见稿.docVIP

前 言 本标准附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心传染病控制所。 本标准主要起草人：涂承宁、赵俊华、冯子力、熊衍文、杨泽、莫秋华、谭华、叶立青。 本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。 国境口岸肠出血性大肠埃希菌O104:H4检验方法 范围 本标准规定了国境口岸EHEC O104:H4检验的检测流程、样品采集与运输、样品处理、检验和报告。 本标准适用于对国境口岸EHEC O104:H4的检验。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.6《食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存》 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 致泻性大肠埃希菌 是指能引起腹泻的一群大肠杆菌。致泻性大肠埃希氏菌可分产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、 肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC) 、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、 肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)。常见致泻性大肠埃希菌见附录A。 产志贺样毒素大肠埃希菌STEC 产维罗毒素大肠埃希菌VTEC 是指能产生志贺样毒素（Shiga toxin）或维罗毒素（Vero toxin）的一群大肠埃希菌。由于志贺样毒素和维罗毒素实际上是同一种毒素，STEC和VTEC用法实际上是相通的。 肠出血性大肠埃希菌EHEC 是一种能产生志贺样毒素的大肠埃希菌，可引起出血性肠炎（hemorrhagic colitis，HC）和溶血性尿毒症综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）。 仪器设备 天平 均质器或乳钵 温箱：36℃±1℃，42℃。 500mL灭菌广口瓶 显微镜 载玻片 酒精灯 接种棒 灭菌的刀子、镊子、勺子。 菌浓度比浊管：Mac Farland3号 麦康凯琼脂； 伊红美蓝琼脂； 三糖铁琼脂（TSI）； 乳糖发酵管； 氧化酶试剂； 革兰氏染色液； 营养肉汤； 肠道菌增菌肉汤； 肠出血性大肠埃希氏菌O104和H4诊断血清； 赖氨酸脱羧酶试验培养基尿素琼脂(pH7.2)氰化钾(KCN)培养基蛋白陈水、靛基质试剂 样本采集 样本采集原则 标本采集的好坏，对整个检验工作的质量影响很大。采集标本以病人粪便为主，粪便标本的采集应争取在发病早期，服用抗菌药物之前并尽快送到实验室。须进行流行病学调查时，可采取可疑食品、水样和环境样本。 采集样本时应注意避免交叉污染。 采集样本时，应戴上乳胶手套和口罩。样本采集完毕，尽快消毒洗手。 拭子采样法 可用棉拭子采取自然排出的新鲜大便； 亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3-5cm处采取。应注意棉拭大小适宜，避免采便量过少。 一般要求水样便采取1-3ml，成形便采取指甲盖大小的粪便量。在某些情况下，病人的呕吐物、沾染粪便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。 座厕采样法 戴上乳胶手套，取一螺旋式密封、已消毒、干燥的容器并做好唯一性标识； 使用座厕时，指导病人将厨用塑料围裙挂在座厕后背上，将围裙体部置于座厕坐板上，使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。尽可能多地将粪便样本采集到上述容器中（推荐采集到10mL以上），置4℃保存并于2h内送检。 如果没有座厕，可使用搪瓷便盆。指导病人将围裙体部置于便盆上（如果便盆经过高压消毒，也可不用围裙），使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。 如果是使用了纸尿布且不会使用座厕的婴幼儿，可将塑料围裙沿着纸尿布边缘放入纸尿布中，如果放置得当，可使粪便和尿液的混合减到最少，从而获得一个较好的样本。 水样采集 按GB5750.2要求进行。 可疑食品采集 按GB4789.1要求进行。 外环境样本采样 使用灭菌棉拭子，涂抹污染对象，然后放入灭菌试管中送检。 运输与保存 采集的样本应按规定作好标识放专用送样箱中于2h内尽快送检。采得的标本不能立即检查的，应接种于保存培养基内（如文腊氏保存液或Cary-Blair二氏半固体保存培养基）尽快送往实验室。送检标本时应填写送检单。 样本处理 采用ELISA方法进行毒素筛查时，参照附录B进行。 采用分子生物学方法进行毒素筛查时，参照附录C进行。 检验方法 vero毒素筛查 酶联免疫吸附法（ELISA法）检测 参照附录B进行。 聚合酶链反应（PCR）法 参照附录C进行。 EHEC O104:H4筛查 参照附录D进行。 分离培养鉴定 分离培养：