入境环保微生物菌剂检测方法 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 入境环保微生物菌剂检测方法 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 9: diarrheogenic Escherichia coli 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人 入境环保微生物菌剂检测方法 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 范围 本标准规定了入境环保微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于入境环保微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 取适量入境环保微生物菌剂，经选择性增菌、分离，对疑似致泻大肠埃希氏菌进行形态学、生理生化、PCR扩增或实时荧光PCR扩增等试验，判定样品中是否含有致泻大肠埃希氏菌。 取样人员在对微生物菌剂的取样过程中，参照我国病原微生物实验室生物安全管理条例，做好个人防护。为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 生理盐水：见附录A中A.1章。 乳糖胆盐发酵管：见附录A中A.2章。 营养肉汤：见附录A中A.3章。 肠道菌增菌肉汤：见附录A中A.4章。 麦康凯琼脂：见附录A中A.5章。 伊红美蓝琼脂：见附录A中A.6章。 三糖铁琼脂：见附录A中A.7章。 克氏双糖铁琼脂：见附录A中A.8章。 糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：见附录A中A.9章。 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.10章。 尿素琼脂：见附录A中A.11章。 氰化钾：见附录A中A.12章。 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.13章。 半固体琼脂：见附录A中A.14章。 氧化酶试剂：见附录A中A.15章。 革兰氏染色液：见附录A中A.16章。 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。 细菌基因组DNA提取试剂盒。 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.17章。 溶菌酶（10 mg/mL）: 见附录A中A.18章。 蛋白酶K（20 mg/mL）：见附录A中A.19章。 10 %SDS：见附录A中A.20章。 3 mol/L乙酸钠：见附录A中A.21章。 dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE：见附录A中A.22章。 Taq DNA 聚合酶。 琼脂糖。 溴化乙锭。 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 电子天平（感量0.01 g）。 拍击式均质器 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃ 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 高压灭菌锅。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 无菌培养皿：直径90 mm。 样品制备：以无菌操作取1 g（mL）样品加入到100 mL生理盐水中混匀，从中移取25 mL至盛有225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 增菌：无菌条件下，移取25 mL上述样品匀液至盛有225 mL肠道菌增菌肉汤的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，将上述样品匀液于42 ℃培养18 h～24 h。 分离：将增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板，于36 ℃土1 ℃培养18 h～24 h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖