入境环保微生物菌剂检测方法 第17部分：恶臭假单胞菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 入境环保用微生物菌剂检测方法 第11部分：恶臭假单胞菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 11: Pseudomonas putida 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人 入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分恶臭碱假单胞菌 范围 本标准规定了。 本标准适用于。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行，三项实验结果。 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 ：见附录A中A.章：见附录A中A.章TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.章10×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾（KCl）15mmol/L氯化镁（MgCl2）。 dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE：54gTris，27.5g硼酸，800ml去离子水溶解，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1L。 Taq DNA 聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。50×TAE缓冲液（pH值8.5）。 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 电子天平（感量0.01 g）。 30 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，41 ℃±1 ℃ 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15 000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 头：10μL、 20μL、 200μL、 1000μL。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 。100μL。 恶臭假单胞菌形态学及生化特征：见表1。 表1 恶臭假单胞菌形态学及生化特征 鉴定项目 恶臭假单胞菌 革兰氏染色 阴性 细胞形状 杆状 形成芽孢 - 聚-β-羟基丁酸盐 - 氧化酶 + 厌氧生长 - ℃生长 41℃生长 PH5.7生长 + PH8.5生长 + - 精氨酸双水解酶 - 脓青素 - DL-精氨酸 - D-核糖 - β-苯丙氨酸 + 果糖 - VP - 反硝化 - 明胶液化 - 淀粉水解 - 葡萄糖 + 海藻糖 +/- L-脯氨酸 + β-苯丙氨酸 + DL-精氨酸 - 2-酮基葡萄糖酸盐 + 类胡萝卜素 - D-木糖 - L-鼠李糖 - 赤藓醇 - MR + 葡萄糖半固体 +/- 细菌模板DNA的提取 直接提取法 取7.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中,10000rpm离心2分钟,尽量弃净上清,沉淀加入TE100μL、10mg/ml溶菌酶100μL,37℃温育30min,12000rpm离心2分钟,沉淀加入TE缓冲液600μL重悬，再加入15mg/ml蛋白酶Ｋ25μl,55℃温育1h后沸水浴10min,12000rpm离心5分钟,取上清保存于－20℃保存以待检测。 有机溶剂提取法 取7.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中,10000rpm离心2分钟,弃上清, 尽量弃净上清,沉淀加入TE缓冲液570μL重悬，然后加入10mg/ml溶菌酶100μL，37℃温育30 min,再加入10%SDS 30μL，65℃温育10min,加入等体积的酚混匀，12000rpm离心10分钟,取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚／氯仿（1:1,体积比）混匀，12000rpm离心10分钟,取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000rpm离心10分钟,弃上清，沉淀用500μL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），－20℃保存以待检测。 试剂盒法 使用商