入境环保微生物菌剂检测方法 第13部分：黄孢原毛平革菌 意见稿.docVIP

前 言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李俊环、张莹、付海滨、王金铃、王芳、贾金生、李成镛 入境环保微生物菌剂检测方法 第13部分：黄孢原毛平革菌 范围 本标准规定了入境环保微生物菌剂黄孢原毛平革菌的形态学鉴定、PCR检测方法。 本标准适用于入境环保微生物菌剂黄孢原毛平革菌检测和鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 取适量入境环保微生物菌剂，将菌剂中的菌进行活化、分离，对该菌进行形态学鉴定，并进行PCR扩增，综合两项实验结果判定是否是目的菌。 人员防护 取样人员在对微生物菌剂的取样过程中，参照我国病原微生物实验室生物安全管理条例，做好个人防护。为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。 主要试剂和培养基 5.1 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 5.2 马铃薯葡萄糖琼脂：见附录A中A.1章。 5.3 马铃薯葡萄糖肉汤：见附录A中A.2章。 5.4 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.3章。 5.5　10×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾（KCl）15mmol/L氯化镁（MgCl2）。 5.6　dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 5.7　TBE：54gTris，27.5g硼酸，800ml去离子水溶解，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1L。 5.8 Taq DNA 聚合酶。 5.9 真菌基因组DNA提取试剂盒。 5.10 50×TAE缓冲液（pH值8.5）：见附录A中A.4章。 5.11 琼脂糖。 5.12 溴化乙锭。 5.13 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 6.1 电子天平（感量0.01 g）。 6.2 恒温培养箱：28℃±1 ℃ 6.3 恒温水浴锅。 6.4 台式冷冻离心机（最高转速15 000 r/min）。 6.5 PCR扩增仪。 6.6 微量移液器和灭菌吸头：10μL、 20μL、 200μL、 1000μL。 6.7 高压灭菌锅。 6.8 PCR超净工作台。 6.9 电泳仪。 6.10 核酸/蛋白分析仪。 6.11 凝胶成像系统。 6.12 无菌培养皿：直径90 mm。 样品制备、培养 7.1 在无菌条件下，取1g（mL）样品加入到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个 PDA培养基平板， 28±1℃培养5天。取样过程中，在样品旁边放置1个PDA琼脂平板作为空白对照。 形态学鉴定 纯化 挑取单菌落划线接种在PDA平板上，28±1℃培养5天，得到纯化的菌株。培养特征：黄孢原毛平革菌在PDA平板上菌落5天长满平皿，白色，毡状，致密。 鉴定 取已纯化的菌株镜检观察其形状。 黄孢原毛平革菌的显微形态特征：菌丝多隔，多分枝。分生孢子梗简单或总状分枝顶端产生芽生分生孢子，分生孢子近球形、椭圆形、倒梨形，无色，稍粗糙，7.5-10×4-6.5μm。有厚垣孢子。 模板DNA的提取 9.1 直接提取法 将已纯化的菌株接种至100mL查氏液体培养基中，25±1℃培养5～10天，得到增菌溶液。无菌挑取溶液中的真菌菌丝0.5～1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入300μL冰上预冷的CTAB 提取缓冲液Ⅰ，加入500μL于65℃预热的CTAB提取缓冲液Ⅱ，1μL 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30min~90min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷却至室温后加入5μL RNase A溶液（10mg/mL），室温下放置30min。室温12000 r/min离心10min，取上清液，分别用等体积Tris饱和苯酚、Tris饱和苯酚+三氯甲烷（1+1）和三氯甲烷+异戊醇（24+1）抽提三次，12000 r/min离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇及1/10 体积3moL/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12000r/min离心10min，弃上清液，用500μL75%乙醇洗涤沉淀两次。除去残留的乙醇，干燥后，DNA 沉淀溶解于100μL TE缓冲液中，-20℃保存备用。 9.2 试剂盒法 使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 DNA质量检测