入境环保微生物菌剂检测方法 第16部分：类产碱假单胞菌 意见稿.docVIP

ICS FORMTEXT 点击此处添加ICS号 FORMTEXT 点击此处添加中国标准文献分类号 FORMTEXT FORMTEXT 中华人民共和国 FORMTEXT 出入境检验检疫行业标准 FORMTEXT XX/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT FORMTEXT 入境环保用微生物菌剂检测方法 第16部分：类产碱假单胞菌 FORMTEXT Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 16: Pseudomonas pseudoalcaligenes FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 XX/T XXXXX—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT 1 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：耿庆华、徐宜宏、林颖、王芳、王金玲、张莹、李俊环、贾金生 入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分 类产碱假单胞菌 范围 本标准规定了入境用环保微生物菌剂类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。 本标准适用于入境用环保微生物菌剂类产碱假单胞菌检测和鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 方法原理 取适量入境环保用微生物菌剂，将菌剂中的菌进行活化、分离，对该菌进行形态学和生理生化试验，并进行PCR扩增，综合三项实验结果判定是否是目的细菌。 人员防护 取样人员在对微生物菌剂的取样过程中，参照我国病原微生物实验室生物安全管理条例，做好个人防护。为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。 主要试剂和培养基 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 营养琼脂：见附录A中A.1章。 营养肉汤：见附录A中A.2章。 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.6章。 10×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾（KCl）15mmol/L氯化镁（MgCl2）。 dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE：54gTris，27.5g硼酸，800ml去离子水溶解，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)定容至1L。 Taq DNA 聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。 50×TAE缓冲液（pH值8.5）：见附录A中A.7章。 琼脂糖。 溴化乙锭。 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 电子天平（感量0.01 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃，36 ℃ 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15 000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 微量移液器和灭菌吸头：10μL、 20μL、 200μL、 1000μL。 高压灭菌锅。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 无菌培养皿：直径90 mm。 样品制备、培养 以无菌操作取1g（mL）样品加入到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃培养24h。取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照。 挑取平板上3～5个单菌落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养肉汤35±1℃ 形态学及生化鉴定 革兰氏染色及芽孢染色 将7.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。 生化鉴定法 取7.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定,每管100μL。 类产碱假单胞菌形态学及生化特征：见表1。 表1 类产碱假单胞菌形态学及生化特征 鉴定项目 类产碱假单胞菌 革兰氏染色 阴性 细胞形状 杆状 形成芽孢 - 聚-β-羟基丁酸盐 - 氧化酶 + 厌氧生长