基于RT-PCR方法检测新甲型H1N1流感病毒.docVIP

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒 一、目的 对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。 二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器 1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104） 2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115） 3、70%乙醇 4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212） 5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111） 6、检测引物 7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C 8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C 9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头 10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器 11、可调转速14K离心机： 12、旋涡混合器： 13、生物安全柜：二级生物安全柜 14、PCR仪： 15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685 16、核酸染料： 17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪 四、实验步骤 （一）RNA提取 1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。 2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。 4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。 5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。 6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。 7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。 8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。 9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。 10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。 注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。 （二）反应体系配制 1、实验设计： 检测标本RNA 质控参数： 阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 阳性对照：已知病毒RNA 2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 1）按下表加入试剂： PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free W