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3．散射光和拉曼光的影响及消除 蕾莱（瑞利）（Rayleigh scattering light）散射光——光子和物质分子碰撞时，未发生能量交换，仅运动方向发生改变，其波长和入射光波长相同，这种散射光叫做瑞利散色光。 发射光波长与激发光波几乎相等。由溶剂、容器、胶体等散射引起，距离荧光峰较远，只要选择适当的波长，由单色器消除。 3．散射光和拉曼光的影响及消除 拉曼散射光Raman scattering light)——光子和物质分子碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，将部分能量转给物质分子或从物质分子得到能量，均使光子能量发生改变。前者使光子能量减少，波长比入射光更长；后者使光子能量增加，波长比入射光要短，这两种光均称为拉曼散色光。 发射光波长与荧光波长相近，即与荧光峰靠近，难区别。由空白溶剂产生。 3．散射光和拉曼光的影响及消除 消除方法：因为荧光波长不随激发光的改变而改变，而拉曼散射光随激发光改变而改变，所以，只要采用波长较短的激发光进行激发，就可避免干扰。 例如，硫酸喹啉及其溶剂（硫酸溶液）在不同波长激发下的散射光。 3．散射光和拉曼光的影响及消除 3．散射光和拉曼光的影响及消除 硫酸喹啉分别用320nm，350nm激发时的荧光光谱。 320nm激发，拉曼光在360nm，对荧光（448nm）无影响；350nm激发，拉曼光在400nm，与荧光（448nm）叠加，产生干扰。因此，采用波长较短的激发光（320nm）进行激发，就可避免拉曼光的干扰。 第二节 分子荧光光谱仪 荧光计、荧光分光光度计基本结构相似。 仪器基本结构 由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器、检测器及记录仪组成。 荧光光谱仪 仪器测量基本原理 由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。可以在溶液的各个方向观察到荧光，但由于激发光一部分可透过溶液，为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。 为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了发射单色器。荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。 注意荧光测量方向。 1. 光源 在紫外-可见区范围，通常的光源是荧光计用溴钨灯或高压汞灯。 荧光分光光度计用氙弧灯，连续光源，可用于200～700nm，在300～400nm光谱强度几乎相等。 新型激发光源：高功率连续可调染料激光光源。 2.单色器 激发单色器（第一单色器）——在光源和样品池之间，滤去非特征波长的激发光。 发射单色器（第二单色器）——在样品池和检测器之间设置，为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，。 荧光计用滤光片作单色器，分光能力差。 荧光分光光度计用棱镜或光栅作单色器，分光能力强。 3. 样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，四面透光，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。 4.检测器 荧光计用光电池或光电管，荧光分光光度计用光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。 第三节 分子荧光光谱法的应用 一、定性分析 二、定量分析 三、其他应用 分析方法的特点 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1～0.001μg/mL之间。比UV-Vis的灵敏度高得多！WHY？ 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 试样量少和方法简单 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。 一、定性分析 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。 定性鉴定物质的可靠性较紫外可见光谱更强，但定性必须有标准物质在同样条件下对照。 二、定量分析 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率φ 。 If = φ Ia 式中φ为荧光量子效率，又根据Beer定律 Ia = I0 - I = I0(1- 10 -? b C) I0和I分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 1．荧光强度与溶液浓度的关系 If = φ I0(1- 10 -? b c) If = φ I0(1- e -2.303?bc) Taylor展开： 当?lc?0.05时， If =2.303φI0?bc 当入射光强度I0 和b一定时，上式为： If=kc 1．荧光强度与溶液浓度的关系 ①即荧光强度与荧光物质