小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究.pdfVIP

卒中与神经疾病2009年2月第 16卷第 1期 ·3 · · 论 著 · 小鼠TNF一基因RNAi慢病毒载体的 构建及体外研究 王雪贞 曾 莉 降 风 唐荣华 张 曼 卜碧涛 【摘要】 目的 为探讨TNF-a在 C型Niemann-Pick病 (NPC)神经变性中的作用，构建携带小鼠TNF- ccsiRNA的慢病毒载体并进行体外研究。方法 设计3个 TNF-a-siRNA序列和 1个无关对照序列，克隆到 酶切的pSIH1一H1一copGFPsiRNA载体；重组质粒转染293T细胞 ，通过实时定量 PCR检测筛选 出干扰效果 最佳的TNF-a-siRNA；筛选出的pSIH—siRNA、pSIH—negative分别与慢病毒包装质粒共转染 293T细胞生成 慢病毒；慢病毒感染 BV-2细胞和星形胶质细胞 ，采用 RT-PCR以及 Elisa检测 TNF_a—siRNA的沉默效果 。 结果 成功构建携带TNF-u-siRNA 的慢病毒载体 ，滴度达 2×10ifu／L；慢病毒感染BV-2和星形胶质细胞 ， 表达 GFP且可下调TN卜a表达。结论 TNPa—siRNA能明显下调 TNF-~的表达，为研究和治疗神经变性 疾病 以及 TNF_a相关疾病提供了有力的工具。 【关键词】 慢病毒载体；TNF-a；神经系统变性疾病；RNA干扰 【中图分类号1 R741 【文献标识码】 A 【文章编号1 1007—0478(2009)01一()()03—04 Constructionoflentivector-mediatedRNAianditefficientlydownregulatesexpressionofmurine INF_ngene invitro WangXuezhen，ZengLi，JiangFeng，eta1．DepartmentofNeurology，TongJiHospital，TongJi MedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030 [Abstract] Objective TostudythefunctionofTNFainNiemann-PicktypeCdiseases，andtOuselenti— viral—deliveredRNA interference (RNAi)tOsilenceexpressionofmurineTNF-ageneinvitro．Methods Three TNF siRNA ofmouseandanegativesequenceweredesignedandclonedintolinearizedpSIH1一H1一copGFP siRNA Vector．Aboverecombinantsweretransfectedbylipofectamineinto293T cells．Thegenesilencingeffi— cacyofthe3targetswascomparedbyreahimePCR．TheoptimizedpSIH1一TNFd—siRNA2andpSIH—negative wereco-transfectedinto293T cellswiththeTNF-a—siRNA wasdeterminedbyRT-PCR inBV-2cellsandas— trocytes．Results SuccessfullyconstructedLentivector-mediated—siRNA ，andthetiteiS2×10ifu／L．RNAi efficientlydownregulatedexpressionofmurineTNF dgeneinvitro．Conclusions TNF siRNA downregula—