NY_T 1244-2006 接触传染性脓胞皮炎诊断技术.docVIP

接触传染性脓胞皮炎诊断技术 Diagnostic techniques for contagious pustular dermatitis 2006-12-06 发布 2007-02-01 实施 前 言 接触传染性脓疱皮炎(Contagious pustular dermatitis，CPD)又称羊口疮(ORF)，是由痘病毒科的副痘病毒引起的绵羊和山羊的一种接触传染性、嗜上皮性疾病，以在口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征。该病在我国属于第三类动物疫病，临床上很难与羊痘、口蹄疫区别。 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位： 本标准主要起草人：龚振华，张彦明，曲志娜，郑增忍，郭福生，党岩，李会荣。 1 范围 本标准规定了接触传染性脓疱皮炎病毒分离试验、电镜检查试验、动物接种试验和琼脂凝胶免疫扩散试验的诊断方法。 本标准适用于接触传染性脓疱皮炎临床诊断和实验室鉴定。2 病原分离 2．1 器材 100 mL玻璃细胞培养瓶，C02培养箱，超净工作台，离心机，倒置显微镜。2．2溶液配制2．2．1试剂 MEM，犊牛血清，水解乳蛋白，谷氨酰胺，胰蛋白酶(为细胞培养级)，青霉素，链霉素，氯化钠，碳酸氢钠，氯化钾，柠檬酸钠(1个结晶水)，磷酸二氢钠(2个结晶水)，葡萄糖，酚红，磷酸氢二钠(12个结晶水)，磷酸二氢钾，硫酸镁(7个结晶水)，无水氯化钙。2．2．2溶液 青链霉素(双抗)溶液，3％谷氨酰胺溶液，7．5％的碳酸氢钠溶液，生理盐水，胎羊皮肤细胞生长液，胎羊皮肤细Hanks母液(10倍浓缩液)，0．01 mol／L PBS溶液，0．25％胰蛋白酶溶液，犊牛睾丸细胞生长液，L—H溶液，犊牛睾丸细胞维持液。溶液配制方法按附录A执行。2．2．3原代胎羊皮肤细胞或羊、犊牛睾丸细胞，制备按附录B执行。2．3样品的准备2．3．1样品的采集2．3．1．1 采集病羊的、唇、乳房等部位的痂皮，置于放有干燥剂(硅胶或其他干燥剂)的灭菌烧杯中，置冰盒内送检。2．3．1．2采集未破裂的丘疹、水疱液，置含有0．01 mol／L PBS缓冲液的灭菌试管中，置冰盒内送检。0．01 mol／L PBS缓冲液的体积不能超过丘疹、水疱液体积的2倍。2．3．2样品的处理2．3．2．1将痂皮剪碎，研磨，按1：5的比例(W／v)稀释于001 mol／L PBS缓冲液中，加双抗(青霉素2000 IU／mL、链霉素2000 mg／mL)，制成悬液。4浸渍16 h20 h，以3000 r／min离心30 rain，取上清液，过滤备用。2．3．2．2丘疹、水疱液加双抗(青霉素2000 IU／mL、链霉素2000 mg／mL)，离心取上清液，稀释、过滤备用。2．4病毒分离培养2．4．1取2．3．2处理好的样品1 mL，接种单层胎羊皮肤细胞或犊牛睾丸细胞，37C吸附1 h，中间摇动一次。2．4．2吸附完后每瓶加入9 mL维持液，37C、5％C02培养箱中培养。2．4．3每天观察细胞病变效应(cPE)，连续观察5 d。如果接毒后1 d～5 d内出现细胞变圆、肿胀，细胞问质增宽，折光性增强，细胞脱落等病变，立即收毒，用方法5进行鉴定。如果盲传3代无CPE，则判 3 病毒的电镜检查 3．1 器材 电镜，普通平皿，滤纸，毛细管。3．2试剂 pH6．8的2％磷钨酸溶液，见附录C。3．3样品采集和处理 方法与2．3相同，或将2．4的CPE培养液反复冻融3次，3000 r／min离心30 min，取上清液备用。3．4试验程序 用毛细管吸少量3．3中的样品或2．4的CPE培养液，直接滴在有支持膜的网上，悬液在网上呈半球形。2 min～3 rain后，用一片干净滤纸从网边吸去液体。用另一毛细管吸一滴磷钨酸染液滴在网上染色1 min。用滤纸吸去染液，立即进行电镜观3．5结果判定 电镜内发现有椭圆形的线团样病毒粒子或发现表面有绳索样结构、以“8”字形相互交织排列的病毒粒子，用方法5进行鉴定。4 动物接种试验4．1试验程序 取样品上清液(见方法2．3)或经细胞培养出现CPE的细胞培养液(见方法2．4)0．2 mL，划痕接种健康3～5月龄羔羊唇黏膜。4．2结果判定 若接种后3 d～4 d出现划线红肿，5 d～7 d出现水疱或脓疱等典型的临床症状，用方法5进行鉴定。若无症状，则判为阴性。5 琼脂凝胶免疫扩散试验5．1 器材 直径6 cm普通平皿，内径4 mm打孔器，微量加样器，37℃恒温箱。5．2试剂 标准阳性抗原、标