出入境口岸手足口病EV71病毒聚合酶链反应检验方法.docVIP

前 言 本标准GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准起草单位：中华人民共和国出入境检验检疫局中华人民共和国出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：、、、、、国境口岸手足口病EV71病毒实时荧光RT-PCR检验方法 范围 本标准规定了国境口岸手足口病EV71病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，EV71病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于国境口岸入出境人员携带病毒的检测。 缩略语 下列缩略语适用于本文件： 实时荧光RT-PCR 实时荧光反转录-聚合酶链反应；Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；RNA 核糖核酸；FAM FAM荧光染料，一种荧光报告基团Hand-foot-and-mouth disease 是婴幼儿常见的传染病，肠道病毒71型是本病流行的主要原因之一。本病临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症，本病目前尚没有公认的特效治疗手段。2008年5月2日我国正式将手足口病列为丙类传染病进行法定传染病管理。 生物安全要求 个人防护参照GB 19489； 实验室应遵循GB 19489和WS 233-2002对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求； 使用过的实验用品应遵照GB 19489对废弃物的处理要求进行无害化处理； 疑似人感染EV71病毒的材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。 标本的采集、运输和保存人mL～3mL保存液的15mL外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。 人粪便 使用洁净、无菌的标本采集盒，采集怀疑感染EV71病毒病人的粪便标本。粪便标本在发病首日采集，至多不能超过急性期（48 h～72 h）,每份稀便标本量约1 mL～5 mL，软便标本量大于8 g。标本采集后不能立即检测的，应在2 ℃～8 ℃贮存，最多不能超过72 h，长期贮存的条件是-20 ℃或以下。 6.3 样品的保存和运送 样品的运送过程要冷藏。样品的保存和运输的生物安全要求参照卫生部颁布的《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和中华人民共和国卫生部第45号令。 标本的处理 标本。 标本核酸提取试剂：用Qiagen公司QIAamp Viral RNA Kit提取病毒核酸公司One step RT-PCR kit2）； 无RNA酶水HM002489.1） 引物/探针名称 序列（5’-3’） 位置VFP TGACGAGAGCATGATTGAGACA 2615-2636 预期扩增片段为86bp VRP CCGCRCTGCTGAAGAAACTA 2681-2700 Probe CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC 2646-2674 (注：探针的5’端标记FAM报告荧光，3’端标记TAMARA淬灭荧光) 检测步骤 核酸提取 吸取140 (加入溶解的(L裂解液 AVL。 脉冲混匀15 s，置于室温10 min。 短暂离心，加入560 (乙醇（96％100％）脉冲混匀15 s。 短暂离心。 将QIAamp旋转柱置于2 m收集管中。从步骤中吸取630 (溶液转移至旋转柱上，6 000 g离心1 min，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖，重复步骤。 打开旋转柱盖，加入500 (AW1，盖紧盖子，6 000 g离心1 min。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖，加入500 ( AW2，盖紧盖子，20 000 g离心3 min。将旋转柱放至干净的收集管上，20 000 g再离心1 min。将旋转柱放至干净的1.5 m离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。 打开旋转柱盖，加入60 (室温平衡的 AVE。 盖紧盖子，室温放置1 min。 6 000 g离心1 min。 收集滤出液，用于。-20或-70储存RNA。 2× One Step RT-PCR Buffer 3 12.5 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL、PrmieScrip RT Enzyme Mix2 0.5 μL、40 μM VFP 0.2 μL、40 μM VRP 0.2 μL、10 μM Probe 0.5 μL、ROX Dye II 0.5 μL、Rnase Free dH2O 5.1 μL、模板RNA 5 μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据EV7