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ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 中华人民共和国检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 出入境口岸病原体环介导PCR检测方法 Loop-mediated PCR test method of pathogen at frontier port SN/T （本稿完成日期：2011-10-20） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　规范性引用文件 1 3　生物安全措施 1 4　术语和定义 1 5　缩略语 1 6　对象 2 7　试剂和材料 2 8　仪器和设备 3 9　检验程序 3 附录A（规范性附录）　水样本采集及处理方式 6 附录B（规范性附录）　粪便、呕吐物样本采集及处理方式 7 附录C（资料性附录）　Cary-Blair二氏培养基配置方法 8 前言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：左锋、柴宏森、杨春江、祁军、刘寅、刘涛。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。出入境口岸病原体环介导PCR检测方法 范围 本标准适用于国境口岸出入境人员或水样本中携带嗜肺军团菌、志贺氏菌、霍乱弧菌的环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）检测。 本标准包括检测对象、样本采集和处理、检验程序、结果判定及报告。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489 实验室 生物安全通用要求 WS 287 细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准 WS 289 霍乱诊断标准 GB/T 6628 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1239 国境口岸霍乱检验规程 SN/T 2528 饮用水中军团军检测 生物安全措施 为保证实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，废弃物应参照《GB19489 实验室 生物安全通用要求》中有关规定执行。 术语和定义 嗜肺军团菌 Legionella 嗜肺军团菌是有鞭毛的革兰氏阴性杆菌，专性需氧，不抗酸、无孢子、无荚膜。菌落特征为灰白色、湿润、圆形、突起、有特殊臭味。嗜肺军团菌主要引起军团菌病，该病流行于夏秋季，主要通过吸入带菌的飞沫而感染。常见的感染源为污染的空调和供水系统。 霍乱弧菌Vibrio cholerae 霍乱弧菌属弧菌属，形态短小、弯曲如狐状，革兰氏染色阴性，菌体一端有单生鞭毛，运动活泼，耐碱不耐酸。霍乱弧菌主要通过污染水源或食物而引起肠道感染，人类是霍乱弧菌的唯一易感者。 志贺氏菌 Shigella 志贺氏菌属肠杆菌科志贺菌属，革兰氏阴性直杆菌，无荚膜，无芽孢，不运动，兼性厌氧。志贺氏菌是细菌性痢疾最常见的致病菌，该病多发于夏季，主要通过食入污染的食物而感染。 缩略语 下列缩略语适用于本标准 LAMP: loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温核酸扩增。 PCR: polymerase chain reaction，聚合酶链反应。 Bst酶：Bst DNA polymerase（large fragment），Bst DNA聚合酶（大片段）。 PBS: phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲液。 对象 嗜肺军团菌检测对象 适用于所有水环境样本中嗜肺军团菌检测，包括轮船压舱水，空调冷凝水、冷热管道系统水、人工管道水源及冷却塔等。 霍乱弧菌检测对象 适用于霍乱弧菌菌株；疑似霍乱弧菌感染人员的排泄物、呕吐物及其增菌液；疑似霍乱弧菌污染的水样本及其增菌液。 志贺氏菌检测对象 适用于志贺氏菌菌株；疑似志贺氏菌感染人员的排泄物、呕吐物及其增菌液。 试剂和材料 除有特殊说明外，所有试剂均为分析纯；实验室用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 引物 嗜肺军团菌引物 （FIP，5’-3’)： TCG GCA CCA ATG CTA TAA GAC AAC TAA TGT CAA CAG CAA TGG CTG C （BIP，5’-3’)： GGC TAA AGG CAT GCA AGA CGT TTC TGA AAC TTG TTA AGA ACG （LF，5’-3’)： CCG ATG CCA CAT CAT TAG CTA CAG ACA （LB，5’-3’)： TTG GCT TTA ACC GAA CAG CA （F3，5’-3’)： AAG ATG AAA TTG GTG