小鼠pcDNA3．1／CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义.pdfVIP

· 论 善 · JMedRes，May2013，Vo1．42No．5 小鼠pcDNA3．1／CXCL14真核表达载体的 构建、表达及意义 杨 帆 张黎 军 李芳芳 蒋小波 摘 要 目的 构建小 鼠pcDNA3．1／CXCLI4真核表达载体 ，观察其在293T细胞 中的表达 ，为进一步探讨 CXCL14对脂肪 细胞 因子 、氧化应激及胰岛素信号转导通路 的影响提供丁具。方法 从 C57／BL胚 鼠肝脏组织 中抽提 RNA，RT—PCR扩增 CX— CL14基因片段 ，并将其插入 pcDNA3．1进行测序 ，鉴定正确构建 pcDNA3．1／CXCL14后转染293T细胞 ，用 RT—PCR法和 Western him法分别从 mRNA水平和蛋 白质水平分另Ij检测 CXCLI4的表达情况 。结果 重构质粒经 PCR、限制性核酸 内切酶 NheI和 XhoI酶切 以及 DNA序列分析鉴定，表 明真核表达载体构建正确 ；以脂质体法转染 293T细胞后 ，RT—PCR、Westernblot能检测 到 目的蛋 白表达。结论 成功构建 了小 鼠pcDNA3．1／CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达。 关键词 CXCL14 真核表达载体 293T细胞 胰岛素抵抗 Construction，ExpressionandSignificanceofpcDNA3．1／CXCL14RecombinantPiasmid． YangFan，ZhangLijun，LiFangfang，Jiang Xiaobo．PeopleSHospital WuhanUniversity，Hubei430060，China Abstract Objective ToconstructtherecombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3．1(一)CXCL14 andexpressitin 293Tcells，thustoprovidetoolsforfurtherstudyoffatceilsfactor，oxidatiestress，andtheeffectofinsulinsignalingpathways．M ethods TheCXCI14wasamplifiedfrom C57／BLratliverbyreversetranscnptasepolymerasechainreaction(RT—PCR)．Thenrecombinedeu— karyoticexpression vectorpcDNA3．1／CXCL14wasconstructed．Afterthereeonbinantplasmidwasproved tobeconstructedcorrectlyby endonucleasesdigestingandDNA sequencing，wetrasfeeted itinto293T cellsthrough liposome inducing．Theexpression ofCXCLI4 in transfectant293TwasdetectedbyRT—PCR andW esternblot．Results Estriction enzymedigestion，PCR amplifyingandDNA sequen— cingconfirmedthatpcDNA3．I／CXCL14hadbeen constructedsuccessfully．BothonthemRNA Ievelandtheproteinlevel，theexpression ofCXCL14wasexpressedobviouslyinthetransfected293T cellsdetectedbyRT—PCR andWesternblotrespectively．Conclusion The recombinanteukaryoticexpressionvectorpcDNA3．1／CXCLI4wasconstructed，and itcouldbeexpressedin293T cells． Key words CXCL14；Eukaryoticexpression vector；293T cells；Insulin resistance CXCL14(MIP一2~／BRAK