淋巴囊肿病毒278ku受体蛋白在牙鲆组织中的分布.docVIP

DOI:10.3724/SP.J.1231.2012.27665 淋巴囊肿病毒27.8 ku受体蛋白在牙鲆组织中的分布 杜程鹏，汪沐，绳秀珍*，战文斌 （中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛 266003） 摘要: 用抗牙鲆血清Ig抗体、抗牙鲆黏液Ig抗体检测牙鲆黏液细胞内的免疫球蛋白，对牙鲆黏液细胞内的免疫球蛋白进行定位。通过对牙鲆皮肤、鳃、胃、肠（前肠、中肠、后肠）、肝、肾（前肾、中肾）、肌肉、脾等进行受体蛋白的间接免疫荧光与免疫组织化学定位观察，发现在牙鲆外周血白细胞的细胞膜、鳃上皮细胞、表皮、胃黏膜上皮细胞顶端、肠上皮细胞、肝细胞、脾表层结缔组织细胞及头肾后端的肾小管上皮细胞内均有较强的阳性信号，表明这些部位分布有LCDV的 27.8 ku受体蛋白，但在体肾、性腺、脑、心脏及外周血红细胞中未观察到阳性信号。推测LCDV通过与鳃、表皮及消化道上皮的受体结合进入牙鲆体内，通过与外周血白细胞上的受体结合侵染白细胞而进入血液循环，进而感染肝脏、脾脏、头肾等器官。 关键词：牙鲆；抗牙鲆血清Ig抗体；抗牙鲆黏液Ig抗体；间接免疫荧光；免疫组织化学；免疫电镜 鱼类黏液细胞(mucous cells) 是普遍存在于鱼类上皮中的一种腺体细胞，主要分布在鱼的皮肤、鳃、肠及口腔的黏膜上皮中，能分泌大量的黏液[1]。鱼类黏液中除了含有多种有机物质，如粘多糖、糖蛋白及各种水解性酶类[2]，还含有特异性的免疫球蛋白（Ig），对鱼类体内的主要免疫系统是一个很好的补充[3-5]，因此对鱼类黏液细胞的深入研究不仅有助于了解鱼类粘液性免疫机制，同时对了解鱼类保护自身免受外界病原生物侵害及鱼类的养殖生产实践等方面有重要的理论和实践意义。关于鱼类黏液Ig的产生、来源目前还存在许多争议。Rombout 等[6]在研究鲤鱼皮肤黏液免疫球蛋白时发现，以纯化的黏液免疫球蛋白制备的单克隆抗体只与黏液免疫球蛋白反应，而不能与血清免疫球蛋白结合。同样，鱼类通过注射、浸泡或口服等途径进行免疫后，在血清和皮肤中抗体出现的时间、效价明显不同[7,8]。推测可能存在独立的粘液免疫系统。而St.Louis-Cormier[9]和Itami[10]发现硬头鳟和香鱼的皮肤黏液免疫球蛋白与各自血清中的免疫球蛋白理化性质一致；杨桂文等[3]通过对鲤鱼肠黏液与鲤鱼血清中IgM的某些理化性质和免疫原性进行比较研究，推断二者具有一定的同源性。因此对黏液细胞内的免疫球蛋白进行定位，对探讨黏液细胞的功能，阐明鱼类黏膜系统的发生与来源，局部体液免疫应答的规律及其介导免疫保护的机理等具有重要意义。 牙鲆作为我国传统的名贵商品鱼和出口创汇重要养殖品种之一，加强其免疫学基础研究对健康养殖、病害防治有着重要的意义。本实验项目就是以牙鲆为实验材料，应用抗牙鲆血清免疫球蛋白及抗黏液免疫球蛋白的单克隆抗体，通过免疫细胞化学及免疫组织化学技术（IHCT），对牙鲆黏液细胞内的免疫球蛋白进行探究，并进一步对其定位，为深入探讨粘液免疫机理奠定基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料及试剂 实验用健康牙鲆购自青岛某鱼类养殖场，体长31.5~39.4cm，体质量550~880g，共2尾。 抗牙鲆血清免疫球蛋白及抗黏液免疫球蛋白的单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗小鼠IgG、氨丙基三乙氧基硅烷（APES）、牛血清白蛋白、NaN3、Heparin、RPMI-1640，购自Sigma公司；生物素化的马抗小鼠IgG、碱性磷酸酶（AP）标记的链霉卵白素及AP-Red发色试剂盒，购自北京中杉公司。 1.2 间接免疫荧光染色（IFAT） 用无菌的剪刀解剖牙鲆，取皮肤、鳃、胃、肠（前肠、中肠、后肠）、肝、肾（前肾、中肾）、肌肉、脾等组织，切成大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，灭菌PBS冲洗干净后，OCT冷冻包埋剂包埋并置于-80℃速冻，冰冻切片机连续切片，厚度5-7μm，丙酮固定10min。 取牙鲆组织冰冻切片进行间接免疫荧光染色，以多种混合单抗2D8（抗牙鲆血清Ig单抗）、抗黏液Ig单抗、抗Ig受体多抗为第一抗体，37℃孵育45min；PBS（暗盒中）洗涤3次，每次5min；第二抗体为FITC标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育45min；PBS洗涤3次，每次5min；甘油封片，Olympus荧光显微镜观察拍照。阴性对照片用骨髓瘤细胞上清代替第一抗体。 1.3 免疫组织化学染色（IHCT） 牙鲆各组织取样方法同1.2。Bouin氏液固定，常规石蜡连续切片，厚度5-7μm，用APES处理的载玻片捞片，40℃烘片，常规脱蜡复水。于切片样品上滴加适量3%乙酸溶液，室温孵育10min，PBS洗涤3次，每次5min；对切片样品进行高压抗原复性（pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，121℃，7min），自然冷却至室温，PB