携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验….pdfVIP

822 Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, July 2010, Vol. 24, No.7 · · 携带人胰岛素基因慢病毒载体转染 人脐带间充质干细胞的实验研究 刘毅 薛美思 【摘  要】 目的 构建共表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP ）基因和人胰岛素 （insulin ）基因的慢病毒载体，探讨其对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells ，hUCMSCs ）的 转染情况，为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。  方法 采用DNA 重组技术，将insulin 基因克隆至带 EGFP 的慢病毒表达载体pLenti6.3- 内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES ）-EGFP 中，筛选阳性克隆， 并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 共同转染到293T 细胞内包装病 毒，荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清，纯化浓缩，测定重组病毒的滴度。取足月儿 脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs ，以不同感染复数（multiple of infection ，MOI ，分别为0、1、3、5、7、10、15、20 ）的 重组慢病毒感染hUCMSCs ，通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI ；以最适MOI 重组慢病毒感染hUCMSCs ， 应用实时荧光定量PCR 及Western blot 法分别检测细胞中insulin 基因及insulin 蛋白水平的表达情况。 结果 成功构 建了共表达insulin 基因和EGFP 基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP ，并对其成功包装、纯化及浓缩，病 8 毒滴度为1.3 × 10 TU/mL 。不同MOI 的重组慢病毒感染hUCMSCs 后，通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适 MOI 为10，此时对细胞的转染效率可达到90% 。实时荧光定量PCR 检测示转染组insulin mRNA 表达阳性，未转染组为 阴性；Western blot 检测示转染组细胞内及上清液insulin 蛋白表达阳性，未转染组均为阴性。 结  论 构建的携带insulin 基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 可有效转染hUCMSCs ，表达insulin 蛋白。 【关键词】    组织工程脂肪 人脐带间充质干细胞 胰岛素 绿色荧光蛋白 基因转染 慢病毒表达 载体 中图分类号： R394.2 Q812 文献标志码：A RECOMBINANT HUMAN INSULIN GENE LENTIVIRUS TRANSFECTING HUMAN UMBILICAL CORD MESENCHYMAL STEM CELLS IN VITRO/LIU Yi, XUE Meisi. Center for Military Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command of Chinese PLA, Lanzhou Gansu, 730050, P.R.China. Corresponding author: LIU Yi, E-mail: liuzhi 【Abstract 】 Objective To construct the lentiviral vector to