日本血吸虫钙网织蛋白活化抗原提呈细胞功能分析.pdfVIP

论文题目： 日本血吸虫钙网织蛋白活化抗原提呈细胞功能的分析 学科专业： 动物学 学位申请人：李莹 指导老师： 冯新港研究员 摘要 日本血吸虫病仍然是流行于我国的人畜共患病之一，长期有效地控制病的流 行有赖于高效安全疫苗的应用。因此，开发高效、安全、实用的抗血吸虫疫苗一 直是血防研究中亟待解决的难题。大量研究表明：通过模拟辐照致弱血吸虫尾蚴 或童虫疫苗(黜W)诱导的高保护性效应机理来研发高效而又安全的分子疫苗， 可能是突破上述难题的有效策略之一。因此，探索RAV的高保护性效应机制成 为研究者们关注的热点课题，其中，RAV的免疫原性的分子与细胞基础及其机 制等问题尤其受到重视。 守的分子，由保守的球状N端结构域和脯氨酸富集结构域、以及酸性的C端结 构域所组成，属于Ca寸结合伴侣蛋白，最初定位于内质网，参与调节蛋白质的正 确折叠、基因转录和翻译后修饰等过程。最近报道，经某些药物或紫外照射等处 理的肿瘤细胞以及凋亡的细胞的CRT会移位至细胞表面，从而给巨噬细胞和树 突细胞(Dendriticcells，DC)等抗原提呈细胞提供了一种“eatme’’信号，最终 导致这些细胞被吞噬和处理；同时，在这些细胞的其他应急分子的共同作用下， 还可增强肿瘤抗原的免疫原性。提示细胞表面CRT的暴露能够引起其被DC吞 E1 噬，从而诱导更强的免疫反应。另外，NaglaaGengehi等人鉴定了曼氏血吸虫 的CRT为辐照致弱疫苗的一种免疫显性T细胞抗原，本课题组陈雷等也发现日 可能是血吸虫RAV中的一个重要的T细胞抗原。因此，可以推断，在RA血吸 虫疫苗模型中，来源于血吸虫的一些保守的应急分子如CRT和HSP70等分子可 能起到了关键作用，它们很可能通过与宿主DC作用，形成引发和驱使保护性的 先天和适应性免疫应答的环境。但是，血吸虫的CRT分子是否能够活化宿主的 DC诱导特征性的先天免疫反应，仍有待进一步研究。因此，本研究在克隆表达 日本血吸虫CRT基础上，观察了该分子在血吸虫不同发育阶段虫体中的定位情 况，并初步分析了sjCRT刺激小鼠抗原提呈细胞的功能特征，旨在为进一步阐 明sjCRT在RAV中的免疫生物学功能和机制提供初步的资料。 首先，应用常规分子生物学技术克隆SjCRT分子，并在原核表达系统中表 分子在不同期别虫体中的组织定位。结果克隆和表达了日本血吸虫重组蛋白 Blot分析显示，该重组蛋白免疫鼠血清可以识别7d、14d、23d、 (rSjCRV)；Westen 血吸虫童虫体表膜呈现明显的荧光信号。 为避免原核表达的蛋白含有脂多糖(LPS)而影响后续实验，采用Bac—To—Bac Blot 杆状病毒真核表达系统进行SjCRT蛋白的表达；His柱纯化表达蛋白，Westen Blot 分析蛋白免疫原性。结果在杆状病毒表达系统中表达了SjCRT蛋白；Westen 分析显示，纯化后的SjCRT蛋白能够被标签His单抗识别，也能被原核表达SjCRT 蛋白的免疫鼠血清所识别，为后续活化DC功能的实验研究提供了材料。 RAW264．7巨噬细胞株具有较强的抗原吞噬功能，是常用的研究先天免疫功 能的细胞模型。本实验采用以原核表达后除去LPS的SjCRT蛋白作为抗原观察 的增殖情况；流式细胞术检测sjCRT蛋白刺激后RAW264．7细胞表面标志分子 MHC 的MHC 为了解sjCRT是否具有活化宿主树突状细胞的功能，本研究采用上述真核 表达的SjCRT蛋白刺激小鼠骨髓里来源的DC细胞，分析刺激后DC表型和功能 成熟的情况。常规方法从Balb／c小鼠骨髓分离、培养和分选得到纯度较高的不 成熟的DC细胞；流式细胞术检测SjCRT蛋白刺激DC细胞表面标志分子MHC II 激小鼠骨髓来源的DC细胞表型的成熟，且具有促进DC细胞分泌Thl类致炎细 胞因子IFN．Y的功能。 总之，本研究克隆表达了日本血吸虫CRT分子，观察到该分子能够在7d、 10d、14d日本血吸虫童虫体表膜呈现，初步查明sjCRT蛋白能够活化宿主的树 突状细胞和巨噬细胞，为进一步阐明SjCRT在RAV中的免疫生物学功能和